pH依赖性条件下冠链球菌（Streptococcus cristatus）降低唾液微宇宙生物膜致龋性的机制研究

本综述系统探讨了口腔共生菌冠链球菌（S. cristatus）作为益生菌在龋病预防中的应用潜力。研究通过体外96孔钉模型构建唾液微宇宙生物膜，发现S. cristatus能有效整合预成膜并显著降低生物量及乳酸产量，同时提升过氧化氢（HP）水平。在模拟致龋环境的pH循环条件下（8小时pH 7.0/16小时pH 5.5），其抑制效果呈现跨供体一致性。微生物组分析显示该菌通过调控链球菌种群（抑制S. salivarius/vestibularis、促进S. mitis群和S. anginosus）增强物种丰富度，逆转pH循环引发的菌群失调。本研究为口腔微生物组靶向调控提供了新策略。

　　

背景

牙科龋病是全球最普遍的疾病之一，影响43%的乳牙和29%的恒牙。该疾病由生态失调的多物种生物膜驱动，微生物通过发酵膳食碳水化合物产生有机酸，降低环境pH值。健康的微生物组通过有效pH缓冲维持共生状态，而频繁糖消耗等致龋条件会导致酸生成过量或中和能力受损，促使微生物群向富含产酸耐酸菌（如变形链球菌和乳杆菌）的生态失调状态转变。传统的龋病预防策略包括减少游离糖摄入、机械清除生物膜、使用化学抑制剂（如氯己定）和氟化物促进再矿化，但这些方法未充分解决维持口腔微生物组平衡的问题。随着对健康口腔微生物群重要性的认识增加，焦点已从广泛抑制口腔细菌转向通过控制致龋菌过度生长并支持微生物多样性和稳定性来调节微生物组。因此，微生物组调节策略，包括使用益生菌，被认为是龋病预防的新颖补充方法。

材料与方法

研究使用冠链球菌LMG22279菌株，常规在BHI琼脂上维护。生物膜生长培养基（BM）包含0.3%酵母提取物、10 mmol/L (NH₄)₂SO₄、35 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgSO₄·7H₂O，并补充过滤灭菌的维生素、氨基酸和0.2%蔗糖。BM的pH通过添加76 mM K₂HPO₄和15 mM KH₂PO₄调整至7.0（BM7），或通过添加100 mM乙酸调整至5.5（BM5）。从四名健康捐赠者收集个体唾液样本，要求捐赠者口腔卫生12小时且至少2小时禁食禁饮。未刺激唾液用60%甘油按1:1比例稀释，并单独存储在-80°C。使用96孔钉模型形成微宇宙生物膜，将个体唾液用新鲜BM7按1:20比例稀释并分装到96孔板中，覆盖含钉的盖子，在厌氧条件下37°C孵育24小时形成预生物膜。随后将钉上预成生物膜转移到含有新鲜BM7或冠链球菌培养物的新96孔板中。冠链球菌培养物在BM7中生长至稳定期，稀释至OD₆₀₀为0.7（对应5×10⁷ CFU/mL），并分装至96孔板，形成两种细胞密度：1×10⁶ CFU/孔（较低密度，MSc_L组）或1×10⁷ CFU/孔（较高密度，MSc_H组）。所有生物膜在两种pH条件下再生长48小时：恒定中性pH和pH循环条件。对于pH中性条件，生物膜在BM7中生长，每8和16小时更换培养基。对于pH循环条件，生物膜在BM7中生长8小时，在BM5中生长16小时。72小时后，钉上生物膜用蒸馏水冲洗10秒以去除残留培养基和未附着细菌细胞，然后收获用于各种测定，包括生物量、乳酸和HP产量以及微生物组成。

通过结晶紫染色测定量化微宇宙生物膜的生物量，将带生物膜的钉插入0.01%结晶紫溶液中5分钟，洗涤后插入2%脱氧胆酸钠中脱色5分钟，使用分光光度计在608 nm处测量脱色溶液的吸光度。生物膜乳酸和HP产量通过将带微宇宙生物膜的钉在测定缓冲液中孵育2小时于37°C，然后立即使用生物膜废液进行HP测量，其余溶液存储在-20°C用于乳酸定量。测定缓冲液是不含酵母提取物和蔗糖但含1%葡萄糖以刺激乳酸生产的BM。通过酶测定法量化生物膜废液中的HP，将50 μL生物膜废液与含2.5 mM 4-氨基安替比林和0.17 M酚的45 μL溶液混合5分钟，随后加入5 μL辣根过氧化物酶（最终浓度640 mU/mL），室温孵育15分钟后，在510 nm处记录吸光度。通过内部协议测量生物膜废液中的乳酸浓度，将生物膜废液与含2.0 M甘氨酸、1.6 M硫酸肼和18 mg/mL NAD的溶液混合，在340 nm处测量吸光度，随后加入5 mg/mL L-乳酸脱氢酶，孵育1小时，340 nm处吸光度的增加反映了通过L-乳酸酶促转化为丙酮酸的NADH形成。

通过16S rRNA基因扩增子测序分析微宇宙生物膜的微生物组成，将带生物膜的单个钉用无菌手术刀从盖子上切下并置于250 μL无DNA Tris-EDTA缓冲液中，随后通过实验室标准基因组DNA（gDNA）提取方案进行提取，包括酚珠击破细菌细胞壁和通过Mag mini试剂盒纯化gDNA。使用带条形码的正向引物（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和反向引物（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增16S rRNA基因的V4高变区，扩增产物等摩尔混合、纯化，并在Illumina MiSeq平台上测序生成251-bp双端读段。原始数据经过质量过滤并在97%相似性下聚类为操作分类单元（OTUs），每个OTU的代表性读段使用RDP分类器和SILVA版本132数据库分配分类学。为了识别特定OTU的分类学名称，将代表性序列通过BLAST与扩展的人类口腔微生物组数据库版本15.2（HOMD）比对。OTU表在每个样本子采样至5,200读段以实现相等深度。

通过物种特异性定量PCR（qPCR）使用分离的gDNA作为模板量化生物膜样本和唾液接种物中冠链球菌的量，冠链球菌特异性引物为：正向，5′-CATTTTACTGCATGGTAAGATG-3′；反向，5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′。反应混合物含SYBR Green，使用LightCycler 480 II分析：95°C预孵育5分钟，然后45个扩增循环（95°C变性10秒，57°C退火和延伸20秒）。基于从纯冠链球菌培养物分离的gDNA得出的标准曲线计算每个样本中冠链球菌的DNA浓度（pg/μL）。

使用SPSS版本24进行双向方差分析（ANOVA）比较三种微宇宙生物膜（M、MSc_L和MSc_H）的生物量形成、乳酸生产和HP生产，以捐赠者和生物膜生长条件（pH中性或pH循环）作为自变量，随后进行Bonferroni事后检验进行多重比较。对于不满足正态分布或方差齐性的数据，包括香农多样性指数、OTUs相对丰度和冠链球菌gDNA浓度，使用非参数检验伴随Kruskal-Wallis进行分析。如果P值小于0.05，则认为差异具有统计显著性。对于测序数据分析，香农多样性指数在PAST版本4.09中计算，并进行上述统计分