DeepRNA-Reg：基于深度学习的配对CLIP实验比较分析新方法，精准解析RNA调控网络

本刊推荐：本研究开发了基于深度学习（deep learning）的算法DeepRNA-Reg，用于高通量交联免疫沉淀测序（HITS-CLIP）数据的比较分析。该工具在灵敏度和精确度上显著优于现有方法dCLIP，可更准确地识别Ago2介导的miRNA靶点，并成功应用于揭示T辅助（Th2）细胞中miR-24/27调控II型免疫的新机制，其预测结果在不同生物学环境中展现出优异的可迁移性。

　　

背景

RNA结合蛋白（RBP）在转录后基因调控中扮演关键角色，尤其在T细胞激活和免疫应答过程中调控网络复杂。高通量交联免疫沉淀测序（HITS-CLIP）技术可实现特定RBP在转录组范围内RNA相互作用的核苷酸级分辨率检测。配对CLIP实验可揭示不同实验条件下RBP的差异行为，然而针对HITS-CLIP比较分析的算法工具仍然稀缺。此前，dCLIP采用隐马尔可夫模型和维特比算法进行差异富集分析，虽然表现可靠，但在检测灵敏度和精确度方面仍有提升空间。为此，本研究提出DeepRNA-Reg，一种基于深度学习的新型算法，旨在为比较HITS-CLIP分析提供更稳健的解决方案。

结果

基准测试设计

DeepRNA-Reg采用递归神经网络（RNN）推断转录组特定区域的差异富集状态。为验证其效能，研究团队利用Ago2 HITS-CLIP（AHC）数据，检测了在缺失特定microRNA（miRNA）的T细胞中miRNA靶点的识别与定位能力。实验使用了来自小鼠野生型（WT）T辅助2型（Th2）细胞和miR-23、24、27基因敲除（KO）Th2细胞的对比AHC数据，这些KO细胞缺失了编码miR-23、miR-24和miR-27家族所有成员的基因组miRNA簇（Mirc11和Mirc22）。此外，还在Th17细胞中进行了WT与miR-29ab1 KO细胞的对比分析，以验证算法的普适性。

基准测试I：灵敏度

miRNA结合强烈依赖于其“种子区”（第2–8位核苷酸）与目标mRNA中互补序列的Watson-Crick碱基配对。DeepRNA-Reg在识别含有种子结合序列的预测靶点方面显著优于dCLIP。在Th2细胞分析中，DeepRNA-Reg预测的WT富集靶点中包含比dCLIP多80%以上的与miR-23、miR-24或miR-27互补的典型（6–8核苷酸匹配）种子结合序列。同样，在Th17细胞分析中，DeepRNA-Reg也捕获了更多典型的miR-29种子结合序列，且对于所有测试miRNA，其识别的8-mer完美种子结合序列数量也更高。

研究进一步利用TargetScan 7.2数据库评估预测准确性。DeepRNA-Reg不仅覆盖了dCLIP捕获的绝大多数TargetScan预测位点，还显著扩展了捕获范围。例如在Th2细胞中，DeepRNA-Reg预测集与dCLIP捕获的341个TargetScan预测重叠306个，并额外捕获293个新位点。这表明DeepRNA-Reg在保持dCLIP预测完整性的同时，提供了更多具有潜在生物学意义的位点。

基准测试II：精确度

DeepRNA-Reg预测的差异富集区域平均尺寸小于dCLIP，且尺寸分布方差显著更低。在Th2和Th17细胞的两个分析体系中，DeepRNA-Reg预测区域内的典型种子序列和8-mer序列更集中于区域中心，显示出更高的定位精度。统计检验（Mann-Whitney U检验）证实了这种中心化趋势的显著性。

基准测试III：实验验证

为评估各算法在减少假阳性方面的能力，研究利用miRNA模拟物转染实验的数据，检验差异结合富集度量（DBE）与miRNA依赖性基因表达变化的一致性。结果显示，DeepRNA-Reg和dCLIP对于DBE前10%的基因均表现出类似的miRNA诱导表达抑制效果，但DeepRNA-Reg在此置信水平下的预测数量几乎是dCLIP的两倍。

通过分析不同DBE阈值下种子序列 motif 的富集情况，发现DeepRNA-Reg预测集中，随着DBE百分位数限制性增加，miR-23、miR-24和miR-27的种子结合序列富集程度呈现明显升高趋势，而dCLIP中的这一趋势较弱。此外，包含一个或多个相关miRNA种子结合 motif 的区域，其DBE度量也显著更高，这一现象在DeepRNA-Reg中更为突出。

MicroRNA对Th2细胞的调控

研究利用DeepRNA-Reg深入探索了miR-24和miR-27在Th2细胞中的调控网络。算法成功检测到已知靶标mRNA（如Ikzf1、Gata3、Aff4和Gpr174）3’非翻译区（UTR）中miR-27典型结合位点处的差异Ago2结合。同样，在Ikzf1、Cnot6和Clcn3中也发现了miR-24典型结合位点的差异富集。值得注意的是，Il4终止密码子后的miR-24种子结合位点处Ago2结合在KO细胞中并未减少，提示可能存在其他miRNA的调控。

为识别新的直接miRNA靶标，研究整合了DeepRNA-Reg预测集与miRNA模拟物转染后的基因表达数据，并进一步利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）知识库筛选出与IL-4调控相关的高置信度靶基因。分析揭示出一系列影响IL-4表达的转录因子，如Rora、Tcf7、Runx1等，并新发现共刺激受体CD28为miR-24和miR-27的直接靶标。流式细胞术证实，miR-23,24,27 KO Th2细胞表面CD28蛋白表达量升高，与miRNA直接靶向调控的假设一致。

miRNA靶点处的RNA二级结构研究

局部A/U富集程度有助于RISC复合体识别mRNA中的miRNA种子结合序列。独立分析验证了小鼠Th2细胞AHC数据中Ago2结合位点两侧存在两个明显的A/U富集区。进一步利用icSHAPE反应性（一种RNA可及性指标）发现，DeepRNA-Reg预测的miRNA靶点周围存在两个 distinct 低结构区域，该信号在dCLIP预测集中较弱。RNAfold软件模拟的二聚化自由能变化分析也表明， miRNA靶点中心10核苷酸周围存在更正的二聚化自由能变化，提示A/U富集可能通过降低二级结构增加靶标可及性。这一结构特征在DeepRNA-Reg预测集中远较dCLIP清晰。

预测miRNA靶标在不同生物学环境中的可迁移性

研究测试了DeepRNA-Reg预测在不同组织间的有效性。利用Kobayashi等提供的脑缺血再灌注（I/R）损伤模型中miR-29活性降低的数据，发现DeepRNA-Reg在Th17细胞中定义的miR-29靶标在皮质细胞氧糖剥夺（OGD）后也显著上调，且最严格分区下的预测集在表达变化幅度和基因数量上均优于dCLIP。此外，在巨噬细胞iCLIP数据中的独立验证表明，DeepRNA-Reg预测的miR-155靶标在WT与KO条件下的表达差异更显著，且高置信度预测数量多出32%。

讨论

DeepRNA-Reg为比较HITS-CLIP数据分析提供了新工具，其在灵敏度和精确度上均优于现有方法dCLIP。该工具不仅能更有效地识别功能可验证的差异结合区域，还能准确捕捉靶点周围的RNA二级结构特征。值得注意的是，DeepRNA-Reg在一种细胞类型中得到的预测可成功迁移至其他组织类型，表明基于实际CLIP数据构建的miRNA靶标数据库可能具有广泛的应用潜力。随着高通量测序数据的不断积累，DeepRNA-Reg将有助于功能注释RNA相互作用组，深化对基因表达调控网络的理解。

方法

算法框架

DeepRNA-Reg算法输入包括两个处理后的BAM文件和一个BED格式的感兴趣基因组位点文件。处理步骤包括：MA标准化、使用Savitzky-Golay算法去噪、深度学习模型推断、以及差异富集区域调用和DBE（差异结合富集）度量计算。最终，根据DBE值的百分位数对预测区域进行评分。

模型设计与训练

深度学习模型采用三层长短期记忆（LSTM）网络（150, 150, 50单元）和一个稠密层（1单元），总参数量312,051，使用Adam优化器和平均绝对误差损失函数。训练数据来自WT与miR-155 KO的配对HITS-CLIP实验，采用留出验证策略评估模型性能。

数据获取

本研究产生的所有测序数据已保存于NCBI GEO， accession number GSE273503。同时使用了多个已公开数据集进行算法训练和验证。