浓度依赖性流感病毒基因组节段间相互作用的形成机制及其在病毒包涵体中的组装意义

本研究发现流感A病毒(IAV)感染的细胞中，病毒核糖核蛋白复合物(vRNP)的局部浓度升高会驱动基因组节段间相互作用网络的形成，这种相互作用与病毒颗粒中的互作模式高度相似。研究人员通过定制化LIGR-seq技术揭示，Rab11A功能缺失虽延迟但最终仍能形成病毒包涵体，而核内vRNP的人工富集也可诱导类似互作，表明病毒基因组组装具有浓度依赖性特性。该研究为流感病毒节段组装机制提供了重要的时空动态见解。

　　

流感A病毒作为重要的人类呼吸道病原体，其基因组由8条单链RNA节段组成，每个病毒颗粒必须精确包装一套完整的基因组节段。然而，这些节段如何在细胞内被选择性组装并包装到病毒粒子中，一直是病毒学领域未完全阐明的关键问题。传统观点认为，节段间通过RNA-RNA相互作用（intersegment interactions）形成束状结构，而病毒包涵体（viral inclusions）——那些在感染后期细胞质中出现的、富含vRNP和宿主蛋白Rab11的液滴状结构——可能为这一过程提供平台。但节段间相互作用的空间与机制动力学，以及病毒包涵体是否真正介导了类似病毒颗粒内的互作模式，仍缺乏直接证据。

为解决这一难题，Naoki Takizawa等研究人员在《iScience》上发表了最新成果。他们通过定制化的RNA相互作用连接与高通量测序技术（LIGR-seq），首次在感染细胞内系统鉴定了流感病毒基因组节段间的互作网络，并揭示了这些相互作用如何依赖于vRNP的局部浓度而在病毒包涵体中形成。

研究主要采用了以下几种关键技术方法：一是利用LIGR-seq结合RNA pull-down技术，全面绘制病毒颗粒及感染细胞中的RNA-RNA互作图谱；二是通过分子生物学和细胞生物学手段，包括构建Rab11A显性阴性（Rab11DN）细胞系、使用核输出抑制剂 leptomycin B（LMB）处理细胞等，操纵病毒包涵体的形成和vRNP的亚细胞定位；三是采用活细胞成像、荧光漂白恢复（FRAP）和电子显微镜等技术，定量分析病毒包涵体的动态特性；此外，还利用SHAPE-seq和计算生物学方法（如RIblast预测）验证互作区域的结构特征。所有测序数据均来自感染MDCK细胞或鸡胚扩增的PR8病毒株，并已存入DDBJ数据库（项目号PRJDB17853）。

Intersegment interactions in purified virion

研究人员首先优化了LIGR-seq技术流程，通过在病毒颗粒中鉴定到787个节段间相互作用，其中与既往SPLASH数据及计算预测（RIblast）重叠的比例分别达到54.7%和62.3%。他们从中提取出83个高置信度的互作位点，发现这些区域在病毒颗粒中具有较低SHAPE反应性（表明形成双链结构），而在纯化vRNA中则无此特征，提示vRNP的组装环境对互作具有重要影响。

Intersegment interaction in infected cells

在感染细胞中，LIGR-seq在8 hpi和16 hpi分别检测到390和431个节段间相互作用，其中与病毒颗粒互作重叠的部分显著富集（p < 0.001）。这表明感染早期即已形成类似病毒颗粒的互作网络，并随时间推移而持续。

Formation of viral inclusions in MDCK-Flag Rab11DN cells

以往研究认为Rab11功能缺失会抑制病毒包涵体形成，但本研究发现，在感染后期（16 hpi），Rab11DN细胞仍能形成病毒包涵体，只是其形态（圆度降低）、运动性（迁移速度减慢）和物理特性（抗低渗处理）有所改变。这些包涵体仍具有液滴样动态特性（可融合、分裂及成分交换），但刚性强于野生型。

Intersegment interaction in infected cells expressing Rab11 dominant negative

关键发现在于：Rab11DN细胞在8 hpi时几乎无法形成与病毒颗粒重叠的互作（仅5个重叠，p = 0.494），但到16 hpi（当包涵体形成后），重叠互作数量显著上升至71个（p < 0.0001）。这表明病毒包涵体的存在（而非Rab11本身）是互作网络形成的前提。

Intersegment interactions under artificially increased local viral ribonucleoproteins concentration

为验证浓度依赖性假说，研究人员用LMB处理细胞以抑制vRNP核输出，导致vRNP在核内聚集。在8 hpi时核内vRNP分布均匀，互作与病毒颗粒无显著重叠（p = 0.455）；但到16 hpi，当vRNP在核内局部浓缩时，重叠互作数量急剧增加至82个（p < 0.0001）。这直接证明即使在不典型的部位（如细胞核），只要vRNP浓度足够高，亦可诱导出病毒颗粒样的互作网络。

讨论与结论

本研究通过高分辨率互作图谱分析，揭示了流感病毒基因组节段组装的新机制：即病毒包涵体通过浓缩vRNP，促进了一个冗余且复杂的节段间相互作用网络的形成，该网络在拓扑结构上（如3′/5′端及中部热点）与病毒颗粒内的互作高度相似。虽然Rab11并非包涵体形成的绝对必需因子，但它通过调节包涵体的物质性质及运动性，影响其成熟及基因组组装效率。

研究的意义在于：首先，它提供了首张感染细胞内节段间互作的动态图谱，将病毒包涵体的物理特性与基因组组装功能直接关联；其次，提出了“浓度依赖性组装”模型，即大规模互作网络先于单个节段套组的选择而形成，这解释了为何病毒包涵体内会容纳多套基因组；最后，技术上的创新（如LIGR-seq的优化与IDR分析）为今后研究其他RNA病毒的基因组组装提供了范式。

当然，研究也存在一定局限性，例如Rab11DN条件下包涵体形成的细胞类型依赖性（A549中无法形成），以及互作网络的功能验证仍面临冗余性挑战。未来研究需进一步揭示单个节段套组如何从大型网络中精选出来，并阐明包涵体解离或转运至病毒出芽位点的具体机制。

总之，这项工作不仅深化了对流感病毒复制周期的理解，也为开发靶向病毒组装的新型抗病毒策略提供了理论基础。