墨西哥过渡带缓步动物新种Diaforobiotus quetzalcoatli sp. nov.的发现：基于多证据整合的分类学研究

本研究报告了在墨西哥过渡带（Trans-Mexican Volcanic Belt）高海拔地区发现并描述的缓步动物新种Diaforobiotus quetzalcoatli sp. nov.。研究采用整合分类学方法，结合光镜（PCM）、共聚焦显微镜、扫描电镜（SEM）以及四个分子标记（COI、ITS-2、18S rRNA、28S rRNA）的DNA序列分析，提供了详尽的形态学描述和遗传学证据。系统发育分析表明该新种与加拿大的D. occidentalis亲缘关系最近，而物种界定分析（COI和ITS2）强有力地支持其作为Diaforobiotus属内的第六个独立物种。此项研究不仅丰富了我们对缓步动物多样性的认识，也凸显了墨西哥过渡带作为生物多样性热点和特有化中心的重要性。

　　

摘要

本研究在墨西哥过渡带（Trans-Mexican Volcanic Belt, TMVB）的Tlaloc山（海拔4037米）的高山草甸环境中，从一个名为Grimmia elongata的苔藓样本中，发现并描述了一个缓步动物（Tardigrada）新种——Diaforobiotus quetzalcoatli sp. nov.。该新种的鉴定与描述基于一个综合性的研究方法，融合了形态学（包括光镜PCM、扫描电镜SEM）、形态计量学以及多基因分子标记（COI、ITS-2、18S rRNA、28S rRNA）的证据。系统发育分析揭示，该新种与来自加拿大的Diaforobiotus occidentalis亲缘关系最为接近。然而，基于COI和ITS2标记的物种界定分析提供了强有力的证据，表明来自墨西哥的种群代表了Diaforobiotus属内的第六个 distinct species（独立物种）。此项发现不仅扩展了该属的地理分布范围，也凸显了墨西哥过渡带这一生物地理交界区域在物种多样性与特有化过程中的重要性。

引言

缓步动物（Tardigrada），俗称“水熊虫”，是一类通过蜕皮生长的微型后生动物。它们栖息环境多样，从海洋到高海拔山脉均可发现其踪迹。其最引人注目的特性是能够进入隐生状态（cryptobiosis），一种生命活动几乎暂停的休眠状态，使其能够抵御极端干旱、冷冻甚至真空环境。目前该门类的分类主要依赖于形态特征（如体型、爪形态、口咽 apparatus 结构、角质层 ornamentation 和附属物、以及卵的 ornamentation）以及相对较短的DNA序列（如COI和ITS-2）。

在墨西哥，针对缓步动物的研究正在逐步增长，但总体而言仍非常有限，大多数已发表的工作集中于物种描述。该国的首个重要贡献是Hoffman和Jiménez于1994年编制的属级 checklist，鉴定了16个属。随后，Kaczmarek等人于2011年发布了首个物种级的 checklist。近期的研究进一步扩展了我们对墨西哥缓步动物多样性的认知，记录显示该国目前有43个属和75个物种。

自2018年起，来自多个墨西哥研究机构的研究人员一直在墨西哥过渡带（Mexican Transition Zone, MTZ）内开展缓步动物编目工作，重点关注横跨墨西哥火山带（TMVB）。该区域位于新热带界（Neotropical）和新北界（Nearctic）两大生物地理区域之间，既是一个 transition zone（过渡带），也是一个 endemism hotspot（特有现象热点）。其复杂的火山历史、孤立的生境、多样的海拔高度和广泛的气候类型，为生物多样性提供了理想条件，并驱动了进化过程。TMVB的环境多样性和高特有性使其成为一个极具潜力的物种发现地，包括缓步动物。

本研究关注的属——Diaforobiotus，由Guidetti等人于2016年建立，用以容纳原先归属于Macrobiotus属（Macrobiotidae科）的物种，现被置于Richtersiusidae科下。目前该属包含五个物种，其中Diaforobiotus islandicus在墨西哥有过记录。本研究在Tlaloc山（TMVB的一部分）发现了一个Diaforobiotus种群，并通过整合形态学、显微成像和分子证据，将其描述为新种Diaforobiotus quetzalcoatli sp. nov.。

材料与方法

采样

采样地点位于墨西哥州的Tlaloc山（一座死火山）。样本采集自海拔4037米的高山草甸西南坡的岩石上的苔藓。苔藓样本被干燥后存放于纸袋中带回实验室。

缓步动物处理

在实验室内，苔藓样本经过复水、震荡、过滤（使用一系列不同孔径的筛网）等步骤，以分离出缓步动物及其卵。

制片与显微镜技术

分离出的标本被分为三部分：一部分制作成永久玻片（用于形态学观察和作为副 genophores）；一部分用于基因组DNA（gDNA）提取；另一部分用于扫描电子显微镜（SEM）观察。观察和拍照使用配备AxioCam ERc 5s数码相机的Zeiss Axioskop显微镜完成。测量工作使用ImageJ软件进行。SEM观察使用Hitachi SU 1510扫描电子显微镜完成。

鉴定、形态计量与形态学术语

标本使用Pilato和Binda（2010）的分类键进行鉴定，并与已知Diaforobiotus物种进行比对。形态计量遵循Stec等人（2016）的建议，所有测量以微米（μm）为单位。形态学术语主要依据Pilato和Binda（2010）。形态计量数据使用Tardigrada Register提供的“Parachela”模板进行管理。

苔藓鉴定

苔藓的鉴定结合了形态学特征和分子标记（rbcL编码区）分析。

缓步动物的DNA测序

采用HotShot技术从单个标本中提取gDNA。扩增了四个分子标记片段：小亚基和大亚基核糖体RNA（18S rRNA和28S rRNA）、内部转录间隔区2（ITS-2）以及细胞色素C氧化酶亚基I（COI）。PCR产物经纯化后测序。

系统发育分析与物种遗传界定

新获得的序列经过校对和验证。使用来自GenBank的Diaforobiotus属其他物种的序列计算了未校正的遗传距离（p-distance）。为了确定新种的系统发育位置，使用串联的18S rRNA + 28S rRNA + ITS-2 + COI序列构建了系统发育树，并以Macrobiotus hannae和M. shonaicus作为外群。序列比对使用MAFFT算法。采用贝叶斯推断（BI）和最大似然法（ML）进行系统发育重建。物种界定使用了三种方法：泊松树过程（PTP）、自动分区组装物种（ASAP）以及单倍型网络分析（对COI和ITS-2分别进行）。

比对材料

新种与所有已知Diaforobiotus物种的原始描述和再描述进行了详细比对，并检查了存放在Bertolani收藏（意大利）和Maucci收藏（意大利）的模式标本。

结果

分类学记述

门 Tardigrada Doyère, 1840

纲 Eutardigrada Richters, 1926

目 Parachela Schuster, Nelson, Grigarick and Christenberry, 1980

科 Richtersiusidae Guidetti, Schill, Giovannini, Massa, Goldoni, Ebel, F?rschler, Rebecchi and Cesari, 2021

属 Diaforobiotus Guidetti, Rebecchi, Bertolani, J?nsson, Kristensen and Cesari, 2016

种 Diaforobiotus quetzalcoatli sp. nov.

模式标本检视

正模标本、22个副模标本及3枚卵制作成霍伊尔（Hoyer）和PVA介质封片；6个副模标本作为 photogenophores（凭证标本）用于DNA提取；另外10个副模和5枚卵用于SEM制备。

模式产地

墨西哥，墨西哥州，Tlaloc山。采集自高山草甸岩石上的苔藓Grimmia elongata (Kaulf.) Brid. 1816中；海拔4037米；坐标：19°24’46.1’’N, 98°43’05.2’’W。

新种描述

动物体：活体标本呈浅绿色，制成玻片后透明。所有标本均可见眼点。体表角质层光滑，全身不规则分布有圆形和椭圆形孔。口围周围具孔。口管刚性，前部略有弯曲。具腹侧 lamina。口腔 armature 具三 band 齿。咽部具三角形 apophyses 和两个 macroplacoids（序列为 1 > 2），呈杆状，第一个具轻微中部缢缩，第二个具明显的亚端部缢缩。无 microplacoid 和 septulum。大多数标本在 apophysis 和口管末端之间观察到两个角质层棘突。爪为 Richtersiusidae 型，主支上具附属点。爪下具角质棒。爪I-III的 lunules 光滑、小、呈不规则梯形；爪IV的 lunules 具齿。所有足上无颗粒物。足I-III具 pulvinus。可见足IV的肌肉线条。

卵：球形。在PCM下，processes（突起）之间的表面分布有微弱暗点。在SEM下，表面光滑，无孔或网状纹饰。processes 细长、锥形，顶端呈 filamentous（丝状）。process 表面从近端到远端覆盖有颗粒物。

繁殖

该新种为雌雄异体（dioecious），雄性具精巢，雌性具卵巢。

模式标本存放地

正模标本（Slide TLPR 37）和15个副模标本（Slides TLPR 1–33）存放于墨西哥国立自治大学生物研究所（IBUNAM）的国家昆虫收藏（CNIN）的缓步动物分馆。两个副模标本（Slides TLPR27 and TLPR71）存放于意大利摩德纳雷焦艾米利亚大学（UNIMORE）的Bertolani收藏馆。

词源学

种加词“quetzalcoatli”来源于阿兹特克神话中的神祇“Quetzalcoatl”（羽蛇神），他是Tlaloc山同名神Tlaloc的兄弟。该名字为男性、单数所有格形式，故以“-i”结尾。

苔藓鉴定

通过形态学和分子数据（rbcL基因），鉴定其栖息苔藓为Grimmia elongata (Kaulf.) Brid. 1816。

系统发育位置与新种的遗传界定

基于串联（18S rRNA + 28S rRNA + ITS-2 + COI）序列的系统发育重建（BI和ML）产生了拓扑结构相似的树。分析恢复了两个单系群，分别对应Diaforobiotus属和Richtersius属。在Diaforobiotus属内，D. hyperonyx构成了其他所有同属物种的姐妹群。其余Diaforobiotus物种中，最基部分支将（D. islandicus, D. svalbardicus）支系与一个亚支系（D. sp. ID.517 + D. occidentalis, D. quetzalcoatli）分开。新描述的种类形成了一个强支持的单系群，与包含D. occidentalis的支系是姐妹群关系。

对于COI数据集，墨西哥种群的序列间差异较低（p-distance 0.1%–4.0%），但与同属其他种群间的遗传距离显著更高（15.8%–21.1%）。物种界定分析（PTP和ASAP）一致地将墨西哥序列归为一个独立的 lineage。ASAP最佳分区（ASAP score = 1.00）识别出六个序列组，对应六个 putative species（推定种）：墨西哥的D. quetzalcoatli sp. nov.、意大利的D. hyperonyx、加拿大的D. occidentalis、冰岛的D. islandicus、挪威的D. svalbardicus以及一个来自印度尼西亚的未鉴定Diaforobiotus物种。单倍型网络分析也支持这一划分。

对于ITS-2数据集，ASAP分析识别出三个组，对应三个推定种：墨西哥的D. quetzalcoatli sp. nov.、意大利的D. hyperonyx、以及一个包含D. islandicus、D. svalbardicus和印尼未鉴定种的组。虽然ITS-2的分辨率低于COI，但墨西哥序列始终聚集在一起，并与同属其他分类单元分离。两种标记提供了一致证据，支持墨西哥种群的遗传独特性和内部一致性。

基因型鉴别诊断

新种与Diaforobiotus属其他已知物种（已有GenBank序列）在不同分子标记上的未校正遗传p-距离范围如下：

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  COI: 16.0–22.0%（与加拿大的D. occidentalis最相似，与意大利的D. hyperonyx差异最大）
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  ITS-2: 12.0–20.0%（与冰岛的D. islandicus最相似，与意大利的D. hyperonyx差异最大）
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  18S rRNA: 0.30–1.62%（与加拿大的D. occidentalis最相似，与意大利的D. hyperonyx差异最大）
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  28S rRNA: 1.25–49.75%（与冰岛的D. islandicus最相似，与西班牙的D. islandicus差异最大）

这些遗传差异百分比超过了该属内常见的物种形成阈值，支持D. quetzalcoatli sp. nov.作为一个新种的有效性。

形态学鉴别诊断

新种通过与所有当前已知Diaforobiotus物种的原始描述和再描述进行详细比对而区分开来。新种以其独特的特征组合而突出，包括光滑的卵、浅绿色色素沉着、以及不同于D. svalbardicus、D. islandicus和D. hyperonyx的细长卵 processes。此外，其在各种解剖结构上的 distinctive morphometric measurements 进一步支持了其与相关物种的区分。报告逐一比较了新种与D. caelicola、D. hyperonyx、D. islandicus、D. occidentalis和D. svalbardicus之间的具体差异（涉及体型、爪分支长度、卵形态、齿列特征、微 placoid 有无等多个方面）。

分种检索表

提供了一个修订后的Diaforobiotus属分种检索表（基于Stec 2023和Massa et al. 2024修改），将新种纳入其中。检索表的关键鉴别特征包括：足I-III lunules是否有齿、爪 common tract 长度、口腔第三 band 齿数、microplacoid 有无、卵表面 processes 间是否有斑点、以及卵 process 基部/高度比等。

讨论

Diaforobiotus是一个相对较新的属，目前包含五个物种和两个亚种。足IV具齿的 lunules 可能是一个同塑性状。口器 armature 是一个关键的形态学特征，其参数（如齿高、宽、间距）对于区分新种具有价值。卵的光滑表面、足I-III的光滑 lunules、绿色色素沉着以及形态计量特征也是区分新种的重要性状。

然而，该属内一些物种缺乏现代物种描述标准所必需的信息，特别是D. caelicola和D. islandicus nicaraguensis，需要从其模式产地重新采样，利用整合分类学方法进行重新审视，以获得形态计量数据、分子分析和高分辨率显微镜图像，这将有助于阐明它们在该属内的系统发育关系。D. occidentalis的近期修订也表明，有必要对该物种进行重新描述和新模指定。

本研究的系统发育分析与Stec和Morek（2022）的拓扑结构一致。分析恢复了两个不同的支系：一个支系包含美洲分布的D. occidentalis和D. quetzalcoatli sp. nov.；另一个支系包含来自北欧岛屿的D. svalbardicus和D. islandicus。这种拓扑结构与物种的地理分布相吻合，支持了美洲支系和欧洲支系的划分。D. hyperonyx作为所有其他Diaforobiotus物种的姐妹群，其独特的进化历史和显著延长的爪主支，使其有可能被提升为独立的属。

近期研究显著提高了Diaforobiotus属内的分类分辨率。随着本研究中D. quetzalcoatli sp. nov.的整合性描述，目前已有五个物种得到了形态和遗传证据的共同支持。尽管如此，D. caelicola仍然缺乏分子数据来支持其系统发育位置。

全面了解缓步动物多样性不仅需要可靠的形态和分子数据，还需要其所在微生境的信息。鉴定出新种的栖息苔藓为Grimmia elongata提供了有价值的生态学背景。虽然先前研究发现缓步动物与特定微生境之间没有一致或排他的关联，但识别精确的基质可以减少未来调查的模糊性。将分子工具（如DNA条形码或宏条形码）用于苔藓的准确鉴定，与苔藓学家合作，可以增强缓步动物研究的生态学分辨率。

分布

已知的Diaforobiotus物种分布揭示了该属具有广泛的生态幅和可辨识的生物地理模式。物种栖息地范围从北极冰川地区（如斯瓦尔巴特的D. svalbardicus）到温带高山区域（如阿尔卑斯山的D. hyperonyx）、墨西哥中部高海拔草原（D. quetzalcoatli sp. nov.），再到北美的温带森林（D. caelicola, D. occidentalis）和南美的热带地区（D. islandicus）。这种环境多样性表明了该属内既存在生态可塑性也存在潜在的特化。生物地理上，D. svalbardicus和D. islandicus聚集在北欧和北大西洋地区，而与美洲的D. occidentalis和D. quetzalcoatli形成对比，这表明了一种可能由历史气候事件（如冰期旋回）塑造的跨大陆分化模式。

结论

Diaforobiotus属是Richtersiusidae科内一个多样化且广泛分布的类群，其物种栖息于北美、南美和欧洲的北极、温带和热带地区。近期的分类学和分子研究，结合形态描述和遗传数据，显著增进了我们对该属的理解。其在加拿大的多个物种表明北美可能是该类群的一个多样性中心。然而，D. quetzalcoatli sp. nov.在墨西哥的发现扩展了该属的已知分布范围，表明其分布可能比先前认为的更广。未来的研究应优先增加分子数据、重新评估分类地位不确定的物种、并探索新的区域，以进一步阐明Diaforobiotus的多样性、进化历史和生物地理学。本研究强调了整合分类学在揭示墨西哥缓步动物多样性中的关键作用，将墨西哥定位为缓步动物研究的重要中心，并突出了其在扩展我们对先前未探索生境中这些微观生物认知方面的重要贡献。