PCSK9通过YAP1–NUPR1轴诱导血管平滑肌细胞铁死亡促进动脉粥样硬化斑块不稳定的机制研究

本研究针对动脉粥样硬化斑块不稳定性这一心血管事件的关键诱因，揭示了PCSK9（前蛋白转化酶枯草溶菌素9型）在脂质调节功能之外的新机制：通过YAP1–NUPR1信号轴诱导血管平滑肌细胞（VSMC）发生铁死亡（ferroptosis），从而加剧斑块脆弱性。研究人员开发了靶向降解PCSK9的PROTAC分子Cadd4，在动物模型中有效逆转斑块不稳定性，为心血管疾病治疗提供了全新策略。

　　

心血管疾病至今仍是全球死亡和致残的主要原因，而动脉粥样硬化是其核心病理基础。尤其值得关注的是，不稳定斑块的破裂或裂隙形成会引发急性冠脉综合征、心肌梗死和脑卒中等严重事件。这类脆弱斑块具有典型特征：纤维帽变薄、富含脂质的坏死核心扩大以及大量炎症细胞浸润。尽管现有降脂治疗取得了一定成效，但直接针对斑块稳定性的靶向干预手段仍然缺乏，这成为临床治疗的瓶颈。

以往研究已知PCSK9是胆固醇稳态的关键调节因子，通过促进低密度脂蛋白受体（LDLR）降解来升高血浆低密度脂蛋白（LDL）水平，加速动脉粥样硬化进程。临床上应用的PCSK9抑制剂可显著降低高危患者的心血管事件风险。有趣的是，这些抑制剂除降脂外，还能增加斑块内血管平滑肌细胞（VSMC）含量、加厚纤维帽，这些都与斑块稳定性改善相关。此外，循环PCSK9水平与冠状动脉病变的坏死核心大小呈正相关，且独立于LDL-C水平，暗示PCSK9可能通过非脂质途径直接影响斑块稳定性。

细胞死亡在晚期动脉粥样硬化病变中十分常见，是导致斑块不稳定的关键因素。特别是VSMC的丢失会显著削弱纤维帽结构。近年研究发现，铁死亡（一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式）在斑块巨噬细胞中可加剧病变不稳定性。更有意思的是，多项研究提示PCSK9可能与铁死亡调控相关——抑制PCSK9可调节铁死亡相关标志物并减轻心肌缺血/再灌注损伤；生物信息学分析显示腹主动脉瘤病变中PCSK9表达与铁死亡相关基因存在相关性。鉴于PCSK9在人类动脉粥样硬化斑块的VSMC中高表达，研究人员推测PCSK9可能直接调控VSMC的铁死亡过程，但具体机制尚未明确。

为探究这一问题，研究人员开展了一系列实验。他们首先通过组织化学染色和免疫组化分析发现，人类脆弱斑块中的PCSK9蛋白水平显著高于稳定斑块，且与斑块不稳定性指标（如VSMC含量减少、胶原分数下降、巨噬细胞浸润增加和坏死核心扩大）密切相关。随后，他们构建了血管平滑肌细胞特异性过表达PCSK9的转基因小鼠模型（PCSK9^{SMC OE}），并结合高脂饮食和AAV8介导的肝特异性PCSK9（D377Y）突变体表达来诱导动脉粥样硬化。

值得注意的是，这些小鼠的血浆脂质谱（包括甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C））与对照组无显著差异，说明PCSK9对斑块稳定性的影响独立于全身脂质水平。组织学分析显示，PCSK9过表达小鼠的主动脉根斑块面积更大，CD68⁺巨噬细胞区域和坏死核心显著增加，而α-SMA⁺的VSMC面积和胶原含量减少，斑块脆弱性指数明显升高。

为进一步探究机制，研究人员对过表达PCSK9的VSMC进行了转录组测序（RNA-seq），发现铁死亡通路显著富集。体内实验证实，PCSK9^{SMC OE}小鼠斑块内游离铁（Fe²⁺）和脂质过氧化标志物4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平升高，同时抗铁死亡酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达下降，促铁死亡酶前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）表达上升。体外实验中，PCSK9过表达导致VSMC活力下降、谷胱甘肽（GSH）耗竭、丙二醛（MDA）和Fe²⁺积累，而这些效应可被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）逆转。

通过机制挖掘，研究人员发现PCSK9过表达显著下调了核蛋白1（NUPR1）的表达——这是一种在细胞应激中上调的蛋白，作为铁死亡的强效抑制剂。单细胞数据分析显示，脆弱斑块的平滑肌细胞中NUPR1表达降低，人类脆弱斑块的免疫荧光结果也证实了这一现象。 rescue实验表明，恢复NUPR1表达可显著逆转PCSK9诱导的铁死亡效应。

深入研究显示，PCSK9并不影响YAP1的mRNA水平，但显著降低其蛋白表达。YAP1 knockdown实验证实YAP1对NUPR1具有正向调控作用。蛋白-蛋白对接分析和免疫共沉淀实验表明，PCSK9与YAP1直接相互作用，并促进其通过溶酶体途径降解。使用溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1（BafA1）或氯喹（CQ）处理可恢复YAP1蛋白水平。

基于上述机制，研究团队借鉴蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）策略，设计了可靶向降解PCSK9的小分子肽Cadd4。该分子由PCSK9结合肽与E3连接酶配体ALAPYIP（带有罗丹明荧光标记）通过连接子偶联而成，能招募VHL E3泛素连接酶使PCSK9泛素化降解。体外实验显示，Cadd4在VSMC中能有效降低PCSK9蛋白水平，且该过程可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断。功能上，Cadd4处理提升了氧化低密度脂蛋白（oxLDL）刺激下的GSH水平，降低了MDA和Fe²⁺积累，同时上调GPX4、下调PTGS2表达，抑制了铁死亡。

在Apoe^?/?小鼠模型中，Cadd4治疗显著降低了斑块内PCSK9水平，改善了斑块稳定性：斑块总面积、CD68⁺巨噬细胞区域和坏死核心减小，而α-SMA⁺的VSMC面积和胶原含量增加，脆弱性指数下降。这些改善伴随YAP1和NUPR1表达的恢复，且独立于血浆脂质水平的变化。

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用人类动脉粥样斑块标本进行组织化学和免疫组化分析；构建血管平滑肌细胞特异性过表达PCSK9的转基因小鼠模型；通过RNA-seq筛选差异表达基因和通路；采用计算机辅助药物设计（CADD）技术开发PCSK9降解剂Cadd4；通过体内外实验验证铁死亡标志物（GSH、MDA、Fe²⁺、GPX4、PTGS2）和分子机制（YAP1–NUPR1轴）。

研究结果部分显示：

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  斑块内PCSK9蛋白水平与人类斑块脆弱性正相关，且在脆弱斑块的VSMC中升高
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  VSMC特异性过表达PCSK9加剧斑块脆弱性
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  PCSK9过表达诱导体内VSMC铁死亡
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  PCSK9在体外促进VSMC铁死亡
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  PCSK9通过下调NUPR1诱导VSMC铁死亡
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  PCSK9通过增强YAP1的溶酶体降解降低NUPR1表达
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  通过PROTAC降解PCSK9抑制VSMC铁死亡
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  通过PROTAC降解PCSK9维持斑块稳定性

研究结论与讨论部分强调，本研究揭示了PCSK9通过YAP1–NUPR1轴诱导VSMC铁死亡进而促进斑块不稳定的新机制，超越了其传统的脂质调节功能。这一发现不仅深化了对动脉粥样硬化发病机制的理解，更重要的是提供了靶向细胞内PCSK9的治疗新策略——基于PROTAC技术的Cadd4分子能有效降解PCSK9，抑制铁死亡，增强斑块稳定性。尽管Cadd4的临床转化仍需进一步评估其药代动力学和安全性，且本研究未探讨Cadd4与现有PCSK9抑制剂的协同效应，但这一工作为心血管疾病治疗开辟了新的方向，展示了靶向蛋白降解技术在复杂疾病治疗中的巨大潜力。该研究发表于《Research》期刊，为动脉粥样硬化斑块稳定性的干预提供了重要的理论和实验依据。