蜡样芽孢杆菌群孢子内孢附属物（ENAs）增强工业表面黏附的物理化学调控机制

本研究揭示了蜡样芽孢杆菌群（Bacillus cereus sensu lato）孢子通过内孢附属物（Endospore Appendages, ENAs）显著增强其在工业材料（如不锈钢和聚丙烯）表面的黏附能力。研究利用野生型及多种基因敲除突变体，结合表面特性分析与环境因子（pH、离子强度、表面活性剂）调控实验，阐明ENAs（包括S-型和L-型）在孢子持久污染中的关键作用，为食品工业中生物膜防控及表面处理策略提供新见解。

　　

ABSTRACT

蜡样芽孢杆菌群（Bacillus cereus sensu lato）的孢子是食品加工环境中的常见污染物，因其能够黏附于表面并抵抗清洁程序。这些孢子具有类似菌毛的内孢附属物（endospore appendages, ENAs），被认为可促进表面黏附。本研究通过比较野生型（WT）Bacillus paranthracis及其缺乏ENAs或外孢囊（exosporium）的等基因突变体，探究了ENAs在孢子对非生物表面黏附中的作用。

INTRODUCTION

蜡样芽孢杆菌群的产孢细菌对食品工业构成重大挑战，频繁污染乳制品、米饭、面食、香料和蔬菜等食品。这类细菌在食品中生长时产生多种降解酶，许多菌株还产生与食源性疾病相关的毒素。其高度耐受的内生孢子（孢子）能够存活于巴氏杀菌、高压、干燥和其他旨在消除污染微生物的食品加工步骤。此外，它们形成的生物膜一旦建立就难以根除。生物膜的保护性胞外基质屏蔽了嵌入的细胞和孢子，使其免受清洁剂和环境胁迫的影响，同时定期向周围释放孢子，导致食品生产环境中的持续污染，对产品安全和质量构成持续威胁。

食品工业中的食品接触表面通常由不锈钢和塑料制成。此外，典型的食品和饮料容器以及用于污染评估的样品瓶和一次性实验室设备通常由塑料和玻璃制成。多项研究表明，蜡样芽孢杆菌群的孢子能有效黏附于这些材料，一些研究将其强黏附性归因于外孢囊的疏水性。此外，表面附属物和低zeta电位被认为显著增强孢子的黏附性。然而，文献中存在不一致的发现，其他研究并未建立与孢子表面疏水性的相同联系，而是将蜡样芽孢杆菌群孢子的强黏附性归因于其表面附属物。

RESULTS

ENAs影响孢子在不锈钢和聚丙烯表面的黏附

通过比较野生型（WT）Bacillus paranthracis NVH 0075/95孢子（S+L+）与缺乏短和长ENAs的光秃孢子（S–L–）以及缺乏完整外孢囊的突变体（ΔexsY）的黏附能力，评估了ENAs在孢子对不锈钢（SS）、聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）和玻璃黏附中的作用。结果显示，ENAs介导的孢子黏附具有表面依赖性。在SS上，野生型孢子表现出最高的黏附效率，而光秃孢子和ΔexsY孢子的黏附显著减少。在PP上也观察到类似模式，野生型孢子的黏附显著高于光秃孢子和外孢囊缺陷孢子。相比之下，在PS和玻璃上，野生型和光秃孢子的黏附效率相当，表明ENAs在这些表面的黏附中作用较小。然而，ΔexsY孢子在玻璃和PS上的黏附再次最低，表明完整的外孢囊可能独立于ENAs在某些表面上促进黏附。

营养细胞的黏附在所有测试表面上均极低，甚至低于ΔexsY孢子，突显了外孢囊和ENAs在Bacillus paranthracis孢子黏附中的独特贡献。

表面和孢子疏水性在孢子黏附中的作用有限

通过静滴接触角测量评估了材料的潜在疏水性差异。PP和PS的接触角大于90°，被归类为疏水性；SS的接触角低于90°，表明为亲水性表面；玻璃的接触角由于基材曲率无法可靠测量。

为了在受控条件下量化黏附，将孢子转移实验调整到具有均匀孔尺寸的96孔微孔板中，并测量600 nm处的吸光度。该设置允许比较孢子在亲水性（PS处理）和疏水性（PS未处理）表面的黏附。结果显示，野生型孢子在疏水性和亲水性表面上均未表现出优先黏附，10次转移后无统计学显著差异。此外，ENAs的存在似乎不影响黏附，因为野生型和光秃孢子对两种表面的黏附效率相似。

通过微生物黏附碳氢化合物（MATH）测试检查ENAs是否影响孢子表面疏水性。结果显示，ENA缺失孢子与野生型孢子之间的疏水性无显著差异，尽管S?L?孢子显示出较高的标准偏差（16%）。相比之下，外孢囊缺陷突变体与野生型和ENA缺失孢子相比疏水性显著降低，表明外孢囊而非ENAs在调节孢子表面疏水性中起关键作用。

不锈钢具有大的表面结构，玻璃表现出整体最低粗糙度

通过扫描电子显微镜（SEM）、张力计、轮廓仪和原子力显微镜（AFM）对测试基材的固有特性进行了详细表征，以深入了解驱动孢子优先黏附特定基材的因素。

SEM显微照片显示，PP、PS和玻璃表面相对光滑均匀，不规则性最小；而SS表面呈现高度纹理化，具有突出的凹槽和脊。通过AFM和轮廓测定法定量这些表面形貌差异，显示玻璃具有最低的粗糙度（5 nm ± 2 nm），其次是PS（29 nm ± 16 nm）、PP（92 nm ± 20 nm），SS显示出最高的粗糙度（7 μm ± 0.4 μm）。表面形貌通过高度图可视化，进一步支持了计算的RMS粗糙度，确认SS具有最粗糙的表面，而玻璃最光滑。此外，计算了表面比率（SR）以评估表面纹理如何导致实际表面积的增加。玻璃和PS的表面比率值接近1，表明由于纹理导致的表面扩张最小；而SS和PP显示出略高的表面比率值（>1），表明由于表面粗糙度导致实际表面积增加。

S-ENAs和L-ENAs的协同效应对于孢子在聚丙烯上的黏附至关重要

使用两种等基因突变株S?L+和S+L?进一步研究了每种附属物类型的具体贡献。结果显示，在PP上，野生型孢子、光秃孢子、外孢囊缺陷孢子和营养细胞之间的黏附存在显著差异，野生型孢子在10次转移后表现出最高的黏附。此外，S+L?和S?L+孢子的黏附均显著低于野生型孢子，表明S-ENAs和L-ENAs都是孢子有效黏附聚丙烯表面所必需的。

在SS上，野生型孢子在10次转移后的黏附显著高于光秃孢子、外孢囊缺陷孢子和营养细胞。然而，与PP上的结果相反，野生型、S+L?和S?L+孢子在SS上的黏附无显著差异，表明在SS上，仅存在S-ENA或L-ENA就足以实现与野生型孢子相当的黏附效率。

ENAs可能对维持孢子在聚丙烯上的长时间黏附至关重要

通过延长孵育实验研究暴露时间对孢子黏附的影响。结果显示，野生型孢子、光秃孢子和表达仅一种类型ENA的突变孢子在1、10和30分钟接触后均保持对聚丙烯表面的高黏附水平。相比之下，外孢囊缺陷突变体在所有时间点均表现出持续弱黏附，突显了外孢囊及其相关附属物在介导稳定表面相互作用中的重要性。

光秃孢子还表现出更瞬时的黏附特征，其黏附在30分钟时达到峰值，表明初始有效结合PP表面的能力；但在60分钟时，其黏附水平急剧下降，与外孢囊缺陷突变体的水平一致。这种黏附的显著下降表明光秃孢子依赖于瞬态结合机制，不足以维持对PP表面的长期附着。

离子浓度影响孢子在不锈钢上的黏附

研究盐和其他相关液体环境因素对孢子黏附的影响。结果显示，野生型孢子在SS表面的黏附在不同pH条件下保持一致，在酸性（0.1 M HNO₃，pH 1.7）和碱性（0.1 M NaOH，pH 13.8）条件下与在无菌水中的黏附无显著差异。相比之下，光秃孢子在酸性和碱性条件下均表现出显著增加的黏附。

在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中也观察到类似模式，光秃孢子在升高离子强度（0.5×和1× PBS）下比在无菌水中黏附更有效。值得注意的是，增加盐浓度不影响野生型孢子的黏附，在所有测试条件下保持恒定。

与向溶液中添加离子的趋势相反，添加BSA降低了野生型孢子在两种测试浓度下的黏附，而对光秃孢子的黏附无显著影响。非离子表面活性剂Tween-20也导致野生型和光秃孢子在0.005%和0.05%浓度下的黏附显著减少。

DISCUSSION

本研究通过比较野生型孢子、一组等基因突变孢子和营养细胞，具体研究了ENAs在孢子对非生物表面黏附中的作用。研究结果表明，ENAs在增强孢子对PP和SS等材料的黏附中起重要作用。虽然表面疏水性似乎不是影响ENA介导孢子黏附的主要因素，但表面粗糙度等特性更具影响力。

理解孢子黏附的重要性在于附着的孢子对各种胁迫表现出显著增加的抗性。例如，附着的孢子可以表现出比未附着孢子增加的碱耐受性和高达400%的热耐受性。这种韧性在食品加工环境和临床环境中构成挑战，其中孢子污染可能导致重大安全和卫生问题。更深入地了解影响孢子附着的因素对于制定有针对性的策略以减轻孢子污染至关重要。这些知识对于设计有效的清洁方案、改进表面材料以减少孢子黏附以及最终最小化孢子在不敏感环境中的持久性风险至关重要。

MATERIALS AND METHODS

孢子制备

使用Bacillus paranthracis菌株NVH 0075/95及其具有不同附属物组成的等基因突变体的孢子，以及具有缺陷外孢囊的NVH 0075/95 ΔexsY突变体。孢子在孢子形成培养基中制备，在37°C摇床培养，当≥90%的营养细胞孢子化时收获，随后用无菌水洗涤并储存于4°C。

黏附实验

孢子黏附测试使用改进的方法进行。最初，根据测量野生型在聚苯乙烯比色皿中达到OD 0.5所需的转移次数确定转移次数为10。将孢子悬浮在无菌水中的浓度调整至OD₆₀₀为0.8，然后依次转移至新的比色皿或管中，并记录每次转移后的OD₆₀₀。OD₆₀₀的减少用作孢子黏附到小瓶表面的间接测量。

随时间评估黏附

将WT和等基因突变株制备如黏附实验部分所述，初始OD₆₀₀调整至0.8。为了观察随时间推移的黏附效果，将管置于HulaMixer中，以40 rpm旋转1分钟、10分钟、30分钟或1小时。每个时间点后，取出管并测量OD₆₀₀。

微孔板实验

使用微孔板比较材料润湿性对孢子黏附的作用。包括代表亲水性表面处理聚苯乙烯的PS Nunclon Delta处理板和疏水性COSTAR PS未处理板。将孢子悬浮液OD₆₀₀调整至0.8，转移200 μL至第一个孔，记录吸光度后，使用巴斯德吸管转移3、6和9次。

微生物黏附碳氢化合物

使用MATH测定估算孢子的相对疏水性。将孢子悬浮液在玻璃试管中稀释至OD₆₀₀约1.6，加入1.5 mL十六烷，剧烈涡旋，静置后测量水相OD₆₀₀，计算相对疏水性百分比。

接触角测量

使用Theta One张力计进行接触角测量。在材料表面上方产生4 μL去离子水滴，立即在10秒内获取150帧图像并确定接触角。

表面粗糙度分析

根据样品类型使用AFM或触针轮廓仪表征表面形貌。AFM扫描（100 μm2）在轻敲模式下进行，SS表面使用触针轮廓仪在1 mm2区域以10 μm横向分辨率扫描。表面图在Gwyddion中处理以最小化成像伪影。

量化了三个关键表面参数：均方根（RMS）粗糙度、表面比率（SR）和自相关长度（ACL）。ACL使用两种互补方法估算：从2D功率谱密度函数（PSDF）导出方向无关的ACL，以及使用Gwyddion的相关长度工具沿水平和垂直轴评估方向ACL。

电子显微镜

使用扫描电子显微镜观察孢子在SS、PP、PS和玻璃表面的黏附。将材料切成适合SEM分析的小块，浸入孢子悬浮液（OD₆₀₀ = 0.8）中孵育1小时，然后用4%甲醛溶液固定，冲洗并干燥过夜。样品涂层后使用扫描电子显微镜捕获图像。

数据分析和统计

使用Prism进行统计分析。对每个实验系列第10次转移的数据应用单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验检查与WT菌株的差异，或Tukey多重比较检验评估所有菌株间的差异。统计显著性指示为：P > 0.05（ns），P ≤ 0.05（），P ≤ 0.01（），P ≤ 0.001（）和P ≤ 0.0001（）。所有P值在补充材料中汇总。使用Origin进行绘图和数据可视化。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢NMBU成像中心的设施和技术援助，以及Ephrem Debebe Zegeye对U.L.A.J.的指导。特别感谢Yohannes Beyene Mekonnen、Kristin (Tina) O'Sullivan、Johan Jonsson和Daniel P. G. Nilsson的技术援助。

这项工作得到了挪威研究委员会（33529）和挪威生命科学大学（NMBUs）研究基金对M.E.A.的资助，以及瑞典研究委员会（2023-04085）对M.A.的资助。