ISO 11731:2017标准下嗜肺军团菌检测方法敏感性比较研究：膜过滤与热处理结合GVPC培养基优化医院水源监测

本研究系统评估了ISO 11731:2017标准中六种军团菌（Legionella）检测方法在医院热水系统中的敏感性。通过276份水样分析发现，采用膜过滤浓缩洗脱结合GVPC培养基及热处理（C2法）的单方法灵敏度最高（76%），而三种方法组合（如B1/C2/D或B2/C2/D）可达98%检出率。研究强调热处理优于酸处理，GVPC培养基显著优于BCYE，为医疗机构水源监测提供了基于证据的优化方案（含<103 cfu/L低菌量样本检测策略）。

　　

ABSTRACT

军团病（Legionnaires’ disease）是一种由吸入含有军团菌（Legionella）的气溶胶引起的严重肺炎，其防控依赖于水源消毒及准确的水质检测。ISO 11731:2017标准提供了多种基于培养的军团菌检测方法，并建议以最不利结果为准。本研究通过分析276份医院热水样本，比较了六种ISO标准化技术（包括培养基选择、浓缩处理和预处理差异），发现120份样本呈阳性，且不同方法间差异显著。敏感性最高的单一技术为膜过滤浓缩洗脱结合GVPC培养基及热处理（C2法），检出率达76%；而三种技术组合（如B2+C2+D或B1+C2+D）可达98%的检出率，六种技术组合则能检出所有阳性样本。浓缩洗脱技术显著优于直接接种或简单过滤，热处理在抑制伴生菌群干扰方面优于酸处理，GVPC培养基的表现一致优于BCYE。本研究支持采用策略性方法组合——特别是膜过滤、GVPC培养基与热处理结合——以优化医疗水系统中的军团菌检测。

IMPORTANCE

本研究具有重要意义，它对ISO 11731:2017标准中多种军团菌检测方法在医院水系统中的敏感性进行了系统评估，为感染防控提供了关键依据。面对不同技术间回收率的显著差异及伴生菌群的干扰问题，研究结果为优化实验室操作流程提供了宝贵见解。通过分析276份水样及六种技术组合，研究者突出了浓缩、膜过滤和热处理（尤其是GVPC培养基）方法的优越性。这些发现不仅支持基于证据的医疗机构环境监测建议，也有助于实验室在准确性、成本与资源分配间取得平衡，对收治易感人群的机构尤为重要——可靠且早期的军团菌检测对预防致命军团病暴发至关重要。

INTRODUCTION

军团病是一种严重且可能致命的肺炎，由吸入来自自然及人工水系统的军团菌污染气溶胶引起。该病可分为社区获得性或医院内感染，呈散发或暴发流行。瑞士国家指南建议医疗机构每年或每半年进行一次水质检测，并以军团菌浓度（cfu/L）为污染阈值。因此，准确计数水网络中军团菌的实验流程对验证控制措施及消毒效果至关重要。标准培养技术是目前最常用的环境监测方法，但其面临两大挑战：一是选择细菌浓缩技术以获得最高回收率（如膜过滤优于离心），二是伴生菌群对军团菌生长的抑制。对此，ISO 11731:2017提出了三种应对策略：在培养基中添加抗生素，和/或对样本进行热处理或酸处理。该标准根据水源类型推荐了三种方法：直接接种、滤膜直接贴琼脂及膜过滤浓缩洗脱。然而所有方法回收率变异较大，导致低浓度军团菌准确定量困难，因此ISO建议报告各方法中的最高cfu/L结果。本研究旨在比较ISO 11731:2017中六种技术（单独或组合）的敏感性，并确定何种组合能在医院热水网络分析中获得最高军团菌污染检出水平。

RESULTS

共分析276份水样，120份军团菌阳性，其中97份仅含嗜肺军团菌（L. pneumophila），15份仅含L. anisa，7份同时含L. pneumophila与L. anisa，1份含L. geestiana。菌落计数按瑞士医院用水阈值分为四组：0（无或<100 cfu/L）、1（100–999 cfu/L）、2（1,000–9,999 cfu/L）、3（≥10,000 cfu/L）。

Combination of techniques to reach the highest sensitivity

六技术组合检出全部120份阳性样本。单一技术中，膜过滤浓缩洗脱结合GVPC培养基及热处理（C2法）敏感性最高（76%，92份阳性），直接接种1 mL于BCYE（A法）最低（34%，41份阳性）。三技术组合中，B1+C2+D或B2+C2+D均达到98%回收率；二技术组合中C2+D最佳（91%）。针对≥10³ cfu/L的检出敏感性，三技术组合A+B1+C1最高（94%），二技术组合中A+C1（84%）和A+C2（83%）较好。低菌量样本（100–999 cfu/L，占阳性样本46.7%）多由C2法检出，而高菌量（≥10,000 cfu/L）多由A、C1和C2法测定。

Discordances between techniques

两两方法比较均存在一方阳性而另一方阴性的情况，且至少一份样本的计数差异≥1 Log₁₀（如<100 cfu/L vs. 1,000–9,999 cfu/L），尤以A法与D法比较时差异最大。

Heat and acid treatment of the concentrates

67份样本在浓缩洗脱后伴生菌群过度生长，需进行热处理或酸处理。其中35份为阳性，21份仅经处理后才检出。热处理后接种GVPC的新增阳性样本最多（17/20），酸处理后接种GVPC或BCYE分别仅检出6/20和8/20，热处理后接种BCYE为11/20。总体来看，热处理（B2、C2）的阳性检出数高于酸处理（B1、C1）。

BCYE vs GVPC media

采用浓缩洗脱法时，GVPC培养基（C1+C2）检出阳性样本数（92/120）多于BCYE（B1+B2，78/120）。热处理样本中，BCYE与GVPC阳性率分别为38%和46%；酸处理样本中则分别为25%和18%。

DISCUSSION

本研究显示不同方法的军团菌计数差异很大，虽然并行使用所有技术可获得最高阳性率，但工作量和成本过高，需策略性选择方法。单一技术仅能检出至多62%的阳性样本，而A+D双技术组合也仅68%，表明必须采用B或C类浓缩洗脱技术以实现最优回收。当伴生菌群显著时，热处理或酸处理可提升检出率，其中热处理结合GVPC培养基的效果最佳，酸处理最差。近半数阳性样本菌量较低（100–1,000 cfu/L），多由B或C法检出。

针对ISO 11731:2017新增的BCYE培养基，本研究显示GVPC的阳性检出率（73%）高于BCYE（43%），与热处理结果一致（但酸处理除外）。研究局限性包括未测试所有ISO替代方法（如A法仅用了BCYE，D法仅过滤10 mL而非100 mL），但结果已足够明确各技术与培养基的优劣。

方法选择需根据污染阈值调整（如公共场所为10³ cfu/L，高危病房需<10² cfu/L）。尽管非肺炎军团菌种（如L. anisa、L. geestiana）致病性较低，但其存在提示水系统具备军团菌定植条件，可能增加肺炎军团菌存活风险。

综上，单一技术不足以保证水样分析可靠性，需采用包含膜过滤浓缩洗脱技术的组合。为优化实验室流程，建议实施C法（膜过滤浓缩洗脱+GVPC接种+必要时热处理）与D法（过滤10 mL+滤膜直接贴GVPC）。

MATERIALS AND METHODS

水样来自医院热水网络，按ISO 11731:2017定义为Matrix A（低干扰微生物预期）。每样本1 L，采用四种技术流程：A法（直接接种1 mL于BCYE）；B法和C法（1 L水膜过滤浓缩后分别接种BCYE和GVPC）；D法（过滤10 mL后滤膜直接贴GVPC）。所有培养基在37°C有氧湿润环境下培养，第3、5、7天观察。若B/C法伴生菌过多，则对浓缩样本分作酸处理（B1/C1）和热处理（B2/C2）后重新接种。疑似菌落经Maldi-Tof鉴定，嗜肺军团菌血清分型采用乳胶凝集试验。以至少一种技术检出为阳性参考计算各方法敏感性（Sensitivity 1），并以≥10³ cfu/L为阈值计算敏感性（Sensitivity 2）。实验室通过ISO 17025认证（STS 0752）。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢流行病学实验室技术员的严谨工作。稿件撰写中使用了ChatGPT优化语言，作者对内容全权负责。