利用环状mRNA提高大肠杆菌生产物质蛋白的效率

《Applied and Environmental Microbiology》：Enhancing Escherichia coli production of material proteins using circular mRNAs

环形mRNA系统通过自切割核酶形成环状结构并加入绝缘RNA环，有效提高mRNA稳定性及重复蛋白表达效率，最高提升2.5倍，同时增强质粒遗传稳定性，为工业级生物制造复杂蛋白材料提供新方案。

　　工业生物生产蛋白质，尤其是基于蛋白质的材料（PBMs），如蜘蛛丝和弹性蛋白，正以惊人的速度发展。这些材料因其独特的机械性能而备受关注，它们在多个领域都具有广泛的应用潜力，包括生物医学、可再生材料以及高强度纤维等。然而，PBMs的高分子量和高度重复的结构特征，给它们的微生物表达带来了诸多挑战。由于PBMs通常来源于长且重复的mRNA，这些mRNA在微生物宿主中极易被内源性核糖核酸酶（RNase）降解，导致蛋白产量低，甚至产生截断产物，从而影响最终材料的性能。因此，如何提高PBMs的表达效率，成为工业生物生产中的关键问题。

本研究通过设计一种圆形mRNA表达系统，旨在提高PBMs的表达水平和mRNA的稳定性。该系统利用自剪切核糖核酸酶（ribozyme）形成圆形mRNA结构，并引入一对绝缘RNA环，以优化蛋白质翻译过程。通过在大肠杆菌中使用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告蛋白进行测试，结果显示，与线性mRNA相比，圆形mRNA使GFP表达量提高了1.5倍。进一步的实验表明，该系统在表达多种PBMs时也表现出显著的提升效果，包括含12个免疫球蛋白（Ig）结构域的titin蛋白、含三个重复单位的贻贝足蛋白（Mfp53）、含96个重复单元的丝蛋白-淀粉样蛋白杂合蛋白（96× FGA）以及来自Nephila clavipes的96个重复单位的拖线丝蛋白（96× Spidroin）。这些PBMs的分子量范围从27 kDa到284 kDa，表现出从线性mRNA表达到圆形mRNA表达时，蛋白产量最高可提升2.5倍。

此外，研究还发现，圆形mRNA不仅提高了蛋白表达水平，还增强了编码PBMs的质粒稳定性。这在以往的实验中是一个被忽视的重要因素。对于高分子量PBMs，如96× Spidroin，使用线性mRNA进行表达时，由于mRNA快速降解和持续转录，容易形成无用的循环，从而对宿主细胞造成代谢负担，甚至引发质粒突变。而使用圆形mRNA后，这一问题得到了显著缓解，只有三份质粒在五个测试样本中保持原始序列，显示出更高的遗传稳定性。这种稳定性对于工业生产尤为重要，因为失败的批次不仅会增加成本，还可能影响产品的质量和一致性。

为了验证圆形mRNA的形成，研究团队采用了逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Sanger测序技术。通过将线性mRNA和圆形mRNA分别进行RNase R处理，可以有效去除线性RNA，而圆形RNA由于缺乏自由的5′和3′端，表现出更高的耐酶性。结果显示，使用圆形mRNA时，有32%的RNA未被RNase R降解，而线性mRNA仅保留17%。这表明圆形mRNA的形成效率至少为18%。通过设计特异性引物，仅能扩增圆形mRNA的连接区域，进一步确认了该系统在形成圆形mRNA方面的有效性。Sanger测序的结果也显示，GFP的3′非翻译区（UTR）成功与5′ UTR连接，证明了圆形mRNA的正确构建。

在实际应用中，该圆形mRNA系统的优势在于其能够有效减少蛋白截断现象，从而确保蛋白分子量的统一性。这对于某些需要特定机械性能的材料尤为重要。例如，在合成丝蛋白纤维的生产中，纤维的强度和韧性与蛋白分子量密切相关。因此，使用圆形mRNA不仅可以提高蛋白产量，还能更精确地控制材料的物理特性，为工业应用提供更大的灵活性。

研究还发现，引入绝缘RNA环对提高蛋白表达具有重要作用。在GFP的表达实验中，仅在5′端添加绝缘环的圆形mRNA表现出与双环结构相似的表达水平，而仅在3′端添加绝缘环的结构则导致表达水平下降。这表明，5′端的绝缘环在防止mRNA二级结构干扰翻译过程中起到了关键作用。此外，研究团队还对不同批次的蛋白表达进行了测试，发现使用圆形mRNA时，蛋白表达的稳定性显著优于线性mRNA。这一发现对于工业生产中的批次一致性至关重要，因为稳定的表达水平可以减少生产中的不确定性和资源浪费。

值得注意的是，尽管圆形mRNA在提高蛋白产量和稳定性方面表现出色，但并非所有PBMs都能从中获得相同的提升效果。例如，96× FGA的表达提升相对较小，这可能与其特定的序列结构有关，导致mRNA的圆形化效率较低。因此，在未来的研究中，可能需要进一步优化绝缘环的设计或选择更适合的PBMs序列，以最大化圆形mRNA的优势。

除了对GFP和PBMs的表达进行测试，研究还探讨了该系统在其他复杂蛋白生产中的潜在应用。例如，该技术可以用于细菌表达具有短寿命mRNA的真核蛋白，这在传统方法中常常面临表达不稳定的问题。此外，圆形mRNA的引入也为合成生物学工具的开发提供了新的思路，可以与其他技术相结合，实现更高效的复杂蛋白合成。

综上所述，本研究通过构建一种包含自剪切核糖核酸酶和绝缘RNA环的圆形mRNA系统，成功提高了PBMs的表达水平和mRNA的稳定性。这一方法不仅在实验室环境中验证了其有效性，还展示了其在工业规模生产中的潜力。未来，进一步优化该系统的参数，如绝缘环的位置、核糖核酸酶的类型以及表达载体的设计，可能会带来更显著的提升效果。同时，结合其他合成生物学技术，如蛋白分泌优化和溶剂条件调整，有望实现PBMs的高效、稳定生产，为可再生材料和生物医学应用提供坚实的基础。