RIPK3/MLKL依赖性坏死性凋亡诱导限制弓形虫复制的机制研究

本研究揭示了在巨噬细胞中，通过TNF-α与Z-VAD-FMK协同激活RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路可有效诱导坏死性凋亡（necroptosis），从而显著抑制弓形虫（Toxoplasma gondii）的复制。这一发现阐明了细胞程序性死亡在抗细胞内病原体感染中的关键作用，为弓形虫病（toxoplasmosis）的治疗提供了新的潜在靶点。

　　

引言

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生原虫，可感染几乎所有有核细胞，引起弓形虫病（toxoplasmosis）。该病在免疫健全者中多呈无症状感染，但对免疫缺陷患者及先天性感染胎儿可导致严重并发症。弓形虫根据毒力与遗传差异分为三种主要谱系：高毒力的I型（如RH株）、中等毒力且最常见于人类感染的II型（如ME49株）以及在实验小鼠中无毒力的III型（如VEG株）。宿主免疫系统在控制弓形虫感染中扮演关键角色，其中程序性细胞死亡（PCD）是清除病原体细胞内复制场所并调节炎症的重要机制。程序性细胞死亡主要包括凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）。凋亡是非炎症性的细胞程序性死亡，而坏死性凋亡则是裂解性、促炎性的程序性死亡形式，其特征是细胞肿胀、质膜破裂及损伤相关分子模式的释放，从而放大免疫反应。坏死性凋亡可由肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）等细胞表面受体触发。当TNFR1被激活，它与RIPK1等蛋白形成复合体I。若RIPK1去泛素化，复合体I解离，在细胞质中形成包含caspase-8的复合体II，后者在活化时启动凋亡。若caspase-8被抑制，RIPK1与RIPK3结合形成坏死小体（necrosome），进而激活MLKL。活化的MLKL转位至细胞膜，破坏离子平衡，导致膜破裂和坏死性凋亡。弓形虫已进化出多种策略以逃逸宿主免疫，包括抑制凋亡。研究表明，弓形虫通过抑制caspase活化来操纵宿主凋亡 machinery。此外，化学化合物如Z-VAD-FMK（广谱caspase抑制剂）可阻断凋亡，从而在某些条件下将细胞死亡平衡转向坏死性凋亡；而Necrostatin-1（Nec-1）可通过结合RIPK1激酶结构域抑制其自磷酸化，从而特异性抑制坏死性凋亡。先前研究提示RIPK3在宿主抵抗弓形虫口服感染中发挥作用，且弓形虫缓殖子期可抑制坏死性凋亡。然而，在弓形虫快复制阶段，宿主坏死性凋亡是否仍能限制寄生虫复制尚不明确。

结果

RIPK3和MLKL缺失不影响初始状态下的弓形虫复制

鉴于RIPK3是坏死性凋亡通路的关键调控因子，本研究首先探讨了其缺失是否会增强弓形虫复制。研究使用MLKL缺失（MLKL^?/?）的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）作为RIPK3依赖性坏死性凋亡的对照。通过感染mCherry标记的II型弓形虫（ME49）速殖子，并在感染后48小时内手动量化每个空泡中的寄生虫数量，发现野生型（WT）、RIPK3^?/?和MLKL^?/? BMDMs之间无显著差异。为进一步延长观察时间，研究测量了直至144小时的mCherry速殖子荧光信号，结果显示弓形虫复制在RIPK3或MLKL缺失的BMDMs中仍不受影响。考虑到不同弓形虫株可引发差异性的宿主反应，研究比较了I型（RH）和II型（ME49）株的复制情况。感染mCherry RH或ME49弓形虫后，在初始BMDMs中，各基因型间的复制均无显著差异。这些结果表明，在基础条件下，弓形虫能够在巨噬细胞中有效复制，且该过程不依赖于关键的坏死性凋亡介质。

TNF-α与Z-VAD-FMK以RIPK3和MLKL依赖性方式限制弓形虫复制

接下来，研究评估了使用促炎细胞因子TNF-α激活坏死性凋亡通路是否足以影响弓形虫复制与存活。结果显示，单独使用TNF-α并不干扰弓形虫的致病性，且与RIPK3和MLKL状态无关。同样，单独使用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK也未影响弓形虫复制或存活。然而，当TNF-α与Z-VAD-FMK联合使用时，在表达RIPK3和MLKL的BMDMs中，弓形虫复制被显著抑制，而该效应在RIPK3或MLKL缺失的BMDMs中未被观察到。在分离的腹膜白细胞中进行的实验也验证了这一发现。这些结果说明，弓形虫复制的抑制依赖于完整的坏死性凋亡信号轴，且需要RIPK3和MLKL的参与。在I型和II型弓形虫株中均观察到类似结果。

RIPK1抑制阻止TNF-α和Z-VAD-FMK介导的弓形虫抑制

为明确坏死性凋亡的完全执行或caspase-8非依赖性机制是否负责影响弓形虫存活，研究引入了Nec-1以阻断坏死小体复合物的形成和坏死性凋亡通路的执行。当BMDMs在Nec-1存在下感染弓形虫时，寄生虫存活不受影响，即使在表达RIPK3和MLKL的细胞中也是如此。进一步地，当Nec-1与TNF-α和Z-VAD-FMK联合使用时，弓形虫复制抑制被完全逆转，表明该抑制需要功能性的RIPK1信号。这些结果巩固了结论，即RIPK1、RIPK3和MLKL的全面参与是实现坏死性凋亡介导的弓形虫限制所必需的。

TNF-α和Z-VAD-FMK诱导的坏死性凋亡导致BMDMs中弓形虫抑制

为确认寄生虫负荷的减少源于成功的坏死性凋亡，研究评估了程序性死亡的标志物，包括膜完整性破坏和磷脂酰丝氨酸（PS）暴露。在健康细胞中，PS局限于质膜的内叶；而在接受凋亡刺激后，PS易位至外表面，允许可测量的结合。在坏死细胞中，由于膜完整性破坏，PS也可被结合试剂访问。研究使用Staurosporine（STS）作为凋亡诱导阳性对照，以及坏死性凋亡对照RIPK3^?/?和MLKL^?/? BMDMs。WT BMDMs在TNF-α和Z-VAD-FMK处理下表现出显著的早期膜破坏和PS暴露，指示坏死性凋亡细胞死亡。相反，在缺乏RIPK3或MLKL的BMDMs中，相同处理未引发这些标志物。重要的是，从裂解宿主细胞中释放的寄生虫（感染后8-16小时）仍保持活力，表明观察到的表型反映的是宿主细胞死亡而非直接寄生虫杀灭。这些功能测定验证了抗寄生虫效应与RIPK3和MLKL依赖性细胞死亡直接相关，确立了坏死性凋亡作为消除弓形虫感染细胞和限制寄生虫传播的有效宿主策略。

讨论

宿主对弓形虫等细胞内病原体的抵抗依赖于先天免疫信号与程序性死亡的精确协调。本研究证实，坏死性凋亡通路的诱导可显著限制BMDMs中的弓形虫复制，但仅在某些特定条件下。研究显示，TNF-α与Z-VAD-FMK联合使用可显著降低WT BMDMs中的弓形虫血症，而在RIPK3或MLKL缺陷的BMDMs中则无此效应。该寄生虫复制抑制源于坏死性凋亡通路的成功完成，导致弓形虫生存与复制所需的宿主细胞缺失。尽管I型和II型弓形虫株在毒力上存在差异，但两者在WT BMDMs经TNF-α和Z-VAD-FMK处理下均显示虫负荷减少，且该效应在RIPK3或MLKL缺失的BMDMs中缺失，表明坏死性凋亡通路可作为对抗细胞内病原体的广谱防御机制。在无任何坏死性凋亡刺激时，RIPK3或MLKL的缺失并不影响BMDMs中的弓形虫复制，提示在基础条件下，坏死性凋亡并未在弓形虫感染中自发激活，其防御角色需通过额外信号诱导。与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和流感A病毒等可独立触发坏死性凋亡的病原体不同，弓形虫在基础条件下似乎规避了该通路。为探究激活坏死性凋亡所需条件，研究评估了TNF-α与Z-VAD-FMK的影响。当单独应用时，两者均不影响弓形虫复制；而联合使用时，则引发寄生虫复制无能，但仅见于WT BMDMs。该效应在RIPK3^?/?和MLKL^?/? BMDMs中的缺失表明，抗寄生虫效应依赖于完整的坏死性凋亡 machinery。使用Nec-1进一步支持了坏死性凋亡的核心角色：当Nec-1与TNF-α和Z-VAD-FMK共同加入时，弓形虫复制抑制被完全逆转，证实RIPK1活性对启动坏死性凋亡信号至关重要。通过评估膜完整性破坏和PS暴露等PCD标志物，研究确认寄生虫负荷的减少与成功的坏死性凋亡相关。WT BMDMs在TNF-α和Z-VAD-FMK处理下显示显著的早期膜破坏和PS暴露，指示坏死性凋亡细胞死亡；而RIPK3^?/?和MLKL^?/? BMDMs在相同处理下未呈现这些标志物。这些功能测定验证了抗寄生虫效应与RIPK3和MLKL依赖性细胞死亡直接相关，确立了坏死性凋亡作为消除弓形虫感染细胞和限制寄生虫传播的有效宿主策略。尽管本研究未聚焦于该方面，但值得注意的是，使用的广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK也可阻断第三种众所周知的程序性死亡机制——炎症小体激活，这可能与观察到的表型相关。未来研究将比较坏死性凋亡（TNF-α + Z-VAD-FMK）与其他程序性死亡类型（如FasL诱导的凋亡或LPS + nigericin诱导的焦亡）后寄生虫的命运，以确定弓形虫存活性是否因宿主细胞死亡通路的不同而异。

材料与方法

研究使用C57BL/6背景小鼠。WT小鼠购自JAX，但与其他所有用于本研究的品系均在威斯康星大学麦迪逊分校动物房内繁殖。RIPK3缺失（RIPK3^?/?）小鼠由Genentech提供；MLKL缺失（MLKL^?/?）小鼠由St. Jude儿童研究医院的Doug Green提供。基因型通过PCR鉴定。实验使用ME49 mCherry和RH mCherry弓形虫株，并在人包皮成纤维细胞（HFF）中于37°C、5% CO₂条件下维持。HFF细胞培养于补充10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺或GlutaMAX、10 mM HEPES和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中。BMDMs取自8-10周龄小鼠，并在20% L929条件化RPMI 1640培养基中培养。体外寄生虫负荷通过免疫荧光手动量化：将1×10⁵活BMDMs种于玻璃盖玻片上，感染1×10⁵ ME49 mCherry速殖子。感染后3小时更换培养基以去除细胞外寄生虫。感染后48小时计数每个空泡中的寄生虫数。动力学寄生虫量化通过免疫荧光在BMDMs中进行：将2×10⁴ BMDMs或腹膜白细胞种于96孔板，感染2×10⁴ ME49 mCherry速殖子或1×10⁴ RH mCherry。感染后3小时更换培养基，并处理BMDMs with TNF-α (30 ng/mL)、Z-VAD(OH)-FMK (20 mM)、Necrostatin-1 (50 mM)和Staurosporine (1 mM)单独或联合使用。加入InuCyte Cytotox Dye以测量细胞膜完整性破坏；加入Incucyte Annexin Dye以量化凋亡/坏死性凋亡。板置于IncuCyte Live Cell Analysis系统上成像，每8-16小时采集图像。空斑试验通过种HFF细胞于24孔板直至形成融合单层，并用 ongoing BMDM弓形虫RH mCherry感染的上清感染进行。上清在感染后8或16小时收集。空斑试验板静置7天使空斑形成，随后用甲醇固定，结晶紫染色20分钟，冲洗、风干过夜后拍照，并使用ImageJ软件计数空斑数。诱导腹膜白细胞收集通过向每只小鼠腹腔注射5 mL硫乙醇酸盐培养基进行。3-5天后，人道处死小鼠，用冷PBS注射入腹腔，按摩后收集细胞悬液，离心弃上清，重悬细胞于培养基中计数。TNF-α bead assay使用BD cytometric bead array mouse inflammation kit测量培养基上清中的细胞因子水平。样品按制造商说明处理，并在威斯康星大学Carbone癌症中心使用Attune流式细胞仪分析，进一步分析使用FlowJo软件完成。

致谢

研究衷心感谢Roshell Pedro在手动寄生虫量化中的协助；感谢Genentech提供RIPK3^?/?小鼠及St. Jude儿童研究医院的Doug Green提供MLKL^?/?小鼠；感谢Wilmara Salgado-Pabon、J.D. Sauer、Jeniel Nett、SciMed Graduate Research Scholars及Knoll实验室成员的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院国立过敏与传染病研究所R01AI144016-01、细胞与分子病理学研究生培训T32奖学金（1T32GM135119-01）、寄生虫学与载体生物学培训计划T32奖学金（5T32AI007414-27）及Robert H. and Carol L. Deibel食品安 research杰出研究生奖学金支持。文中表达的任何观点、发现、结论或推荐均为作者观点，不一定反映资助机构的看法。