约翰斯·霍普金斯医疗系统2024–2025呼吸道季呼吸道合胞病毒全基因组序列特征研究

本文系统报道了约翰斯·霍普金斯医疗系统在2024–2025呼吸道病毒流行季对呼吸道合胞病毒（RSV）的全基因组监测成果。研究采用长片段扩增与纳米孔测序技术，首次揭示马里兰州RSV-A亚型进化优势（94.9%）与A.D.1.6进化枝区域扩张（68.34%），发现表面蛋白糖基化位点变异与抗原逃逸潜在关联，为疫苗与单抗（mAb）有效性评估提供关键分子依据。

　　

ABSTRACT

呼吸道合胞病毒（RSV）仍是全球婴幼儿、老年人及免疫低下人群下呼吸道感染的主要病原体。随着2023年首批RSV疫苗上市及单克隆抗体广泛应用，基因组监测对评估其有效性及抗体耐药基因型涌现至关重要。本研究通过重叠扩增子与纳米孔测序技术，对2024年9月至12月流行季的RSV毒株进行全基因组表征，分析亚型分布、进化枝流行度及氨基酸变异，并结合流行病学数据评估病毒变异与临床结局的关联。

INTRODUCTION

RSV属于肺炎病毒科（Pneumoviridae），携带约15.2 kb负链RNA基因组，编码11种蛋白。其表面G蛋白介导病毒附着，F蛋白促进膜融合，二者是中和抗体的主要靶标。基于G基因变异性，RSV分为A、B两大亚型，其中ON1（GA2.3.5）和BA9（GB5.0.5a）为当前全球主导基因型。本研究优化长片段扩增方案，首次实现RSV-A与RSV-B全基因组高效测序，旨在揭示马里兰州流行毒株的分子特征与临床关联。

MATERIALS AND METHODS

研究样本来自约翰斯·霍普金斯医疗系统（JHHS）常规检测阳性标本，通过靶向N基因的Cepheid Xpert或GenMark ePlex平台筛选。核酸提取后采用M基因特异性RT-qPCR测定Ct值。针对RSV-A和RSV-B基因组设计四组重叠引物，经多重PCR扩增后构建纳米孔测序文库。使用BLAST比对参考基因组（MH447951/OP975389），经Medaka抛光获得高质量共识序列。进化枝分类通过Nextclade（v3.15.3）完成，系统发育树采用IQ-Tree构建。氨基酸变异分析以hRSV/A/England/397/2017为参考，糖基化位点通过NetNGlyc 1.0与NetOGlyc 4.0预测。临床数据通过单变量逻辑回归分析关联性。

RESULTS

RSV流行特征与队列分析

2024年6月至2025年1月，JHHS呼吸道病原检测中肠道病毒/鼻病毒（21.65%）、SARS-CoV-2（9.53%）和RSV（9.37%）阳性率居前。RSV阳性样本中随机测序获得336条高质量基因组，RSV-A占94.9%（319/336）。患者中位年龄2岁，1–5岁儿童占比56.2%（189/336）。常见合并症包括肺部疾病（17.3%）和癌症（13.7%），6%存在共感染（以肠道病毒/鼻病毒为主）。20.2%患者需住院，15.8%需吸氧，4.5%需ICU护理。逻辑回归显示糖尿病显著增加住院风险（OR=10.13, P=0.001），心衰与吸氧需求相关（OR=5.69, P=0.02），免疫抑制与ICU入住率显著关联（OR=3.96, P=0.02）。

全基因组系统发育分析

RSV-A共识别10个进化枝，其中A.D.1.6占主导（68.34%, 218/319），呈现高度簇集与低枝内多样性。RSV-B仅检测B.D.E.1（94.12%）与B.D.E.1.1两个进化枝。所有RSV-A属ON1基因型（GA2.3.5），RSV-B属BA9基因型（GB5.0.5a）。本地毒株与欧洲（乌克兰、西班牙等）及墨西哥毒株聚类，提示潜在国际传播链。

G与F蛋白氨基酸多态性

G蛋白发现28个氨基酸置换，57.1%位于第二高变区（HVR2）。I134K与D284G为全局固定突变。跨膜区A57T（11.04%）为新增变异。糖基化分析显示S100N（11.1%）引入新N-糖基化位点，T137K（11.6%）导致缺失。O-糖基化预测提示P217S（68.47%）与G296S（68.79%）新增位点，而S299N（69.52%）等导致三位点缺失。

F蛋白识别13个置换，其中抗原位点Ⅱ区K272N（4.4%）与S276N（2.2%）可能影响帕利珠单抗（Palivizumab）中和效能。T122A（8.8%）导致N-糖基化位点丢失，39个序列（12.2%）获得潜在O-糖基化位点（主要位于244位）。疫苗靶向位点（S155C/S190F/V207L/S290C）均未发生变异。

其他蛋白变异谱

L蛋白18个置换中50%聚集于连接域（CD），33.3%位于RdRp域。P171L、R256K、Y598H等为固定突变。M、M2-1、M2-2、N、P、SH蛋白均发现高频变异，NS1无变异。N蛋白V352A、P蛋白L55P、M2-1蛋白S176P等成为全局固定突变。

DISCUSSION

后疫情时代RSV流行模式逐步回归季节性特征，本季RSV-A优势流行与A.D.1.6进化枝区域扩张反映病毒通过免疫逃逸与传播力优化适应群体免疫压力。G蛋白糖基化模式动态变化可能介导抗原掩蔽或暴露，F蛋白抗原位点Ⅱ区变异需关注单抗有效性风险。L蛋白RdRp与CD域突变簇提示潜在复制适应性进化，但未发现已知耐药突变（如Y1631H/C）。研究局限性包括RSV-B样本量少、糖基化预测未实验验证及缺乏个体级免疫干预数据。全基因组监测为疫苗与抗病毒策略优化提供了关键分子流行病学依据。

ACKNOWLEDGMENTS

研究由约翰斯·霍普金斯流感研究与响应中心（HHS 75N93021C000045）资助。感谢JHHS微生物实验室技术支持。