肠道-喉轴及其对喉免疫的贡献：揭示肠道菌群失调如何重塑喉部免疫微环境

本研究首次提出“肠道-喉轴”概念，通过单细胞转录组学技术揭示抗生素诱导的肠道菌群失调（AB）显著改变喉部细胞比例、基因表达调控网络和细胞间通讯，尽管喉部微生物群组成保持稳定。研究发现整合素介导的信号传导（integrin-mediated signaling）成为免疫-上皮相互作用的关键通路，Etv4(+)、Irf3(+)、Hltf(+)、Mga(+)、Nfil3(+)等调节子（regulon）活性显著变化，为呼吸道免疫调控提供了全新视角。

　　

ABSTRACT

喉作为上呼吸道的关键器官，在吞咽、呼吸、咳嗽和发声过程中发挥核心作用，其功能依赖于独特的微生物和免疫微环境。本研究提出“肠道-喉轴”假说，认为肠道和喉部常驻微生物群可协同调控喉部免疫应答。通过给常规饲养的野生型C57BL/6J小鼠实施口服抗生素方案（含氨苄青霉素、甲硝唑、新霉素和万古霉素）破坏肠道菌群，并与未处理对照组进行比较。结果显示抗生素处理显著破坏肠道微生物群，但喉部微生物群基本未受影响。然而，抗生素处理组小鼠表现出喉部上皮细胞、免疫细胞和纤维细胞的显著变化。差异基因表达分析揭示了与上皮屏障完整性、免疫信号传导和细菌应答相关通路的改变。基因调控网络分析发现Etv4(+)、Irf3(+)、Hltf(+)、Mga(+)和Nfil3(+)等调节子活性发生显著变化。此外，细胞间通讯（特别是免疫-上皮相互作用）发生改变，整合素介导的信号传导成为关键通路。这些发现表明肠道和喉部微生物群可能协同调节免疫应答，凸显了肠道-喉相互作用在呼吸道免疫中的重要性。

INTRODUCTION

过去二十年中，肠道微生物群在人类健康和疾病中的作用已得到充分证实。肠道微生物群尤其对宿主免疫发育和调控至关重要，不仅影响胃肠道局部免疫，还调节全身免疫功能。肠道菌群失调（微生物平衡破坏）会导致多种肠道病理状况（如肥胖和营养不良）、系统性疾病（如糖尿病）、慢性炎症性疾病（如炎症性肠病IBD）和自身免疫性疾病。由于其与肺、脑、心、肾和皮肤等肠外器官的多向联系，肠道微生物群被视为人体内的“隐藏器官”。

新兴的“肠-肺轴”概念强调了肠道微生物群与呼吸道之间更广泛的相互作用网络。人类和动物研究均表明，肠道菌群失调与呼吸道感染易感性增加、免疫防御功能受损和肺部炎症反应加剧相关。这些效应可能由肠道来源的微生物代谢物（如短链脂肪酸SCFAs）介导，这些分子被运输至肺部后促进调节性T细胞分化、维持免疫稳态并抑制炎症反应。此外，在肠道中预激活的免疫细胞迁移以及脂多糖（LPS）和其他细菌产物可进入全身循环，导致肺内免疫细胞群改变或炎症加重。

喉作为上呼吸道的重要组成部分，在调节呼吸、发声和吞咽过程中的气道保护方面发挥关键作用。它还是上下气道之间的关键解剖和免疫守门员，确保只有经过过滤和调节的空气进入肺部。喉作为吸入性环境暴露和病原体的关键屏障和感觉器官，能够早期检测和响应有害刺激。因此，喉功能障碍可能通过增加误吸、感染或炎症风险而损害肺部健康。喉具有独特的免疫结构，可抵御病原体和外部刺激，并有效管理喉部疾病（如良性声带病变、喉炎、喉乳头状瘤病甚至癌症）。先前研究表明该器官是微生物定植的选择性环境， distinct微生物群落显著影响宿主免疫，有助于调节炎症反应和维持屏障完整性。鉴于喉与肺的解剖邻近性及其作为免疫守门员的作用，我们假设存在一个“肠道-喉轴”，其中肠道微生物群与喉部常驻微生物协同工作，共同调节上呼吸道这一关键区域的免疫应答。

RESULTS

Alteration of gut microbiota through antibiotic treatment in conventionally raised mice

对8-10周龄常规饲养小鼠进行为期2周的口服抗生素处理（含氨苄青霉素、甲硝唑、新霉素和万古霉素）。所有抗生素处理（AB）小鼠在整个治疗期间保持警觉，呼吸稍快，活动减少，但眼睛、鼻子和脸颊正常。雄性和雌性小鼠在治疗期间毛发略显粗糙，可能因饮水量轻微减少所致。AB小鼠在2周治疗期间体重轻微减轻，但与未处理对照（CT）组相比无显著差异。AB小鼠治疗后观察到盲肠明显肿大，类似于无菌（GF）小鼠中典型的盲肠肿大现象。

通过16S rDNA定量PCR（qPCR）评估AB和CT小鼠喉部和盲肠的总细菌丰度。AB小鼠盲肠细菌丰度显著降低，而喉部未见差异。在添加5%绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上培养盲肠和喉部微生物群，需氧条件下孵育2-3天。AB小鼠盲肠需氧/兼性厌氧菌的菌落形成单位（CFU）显著低于CT小鼠，而两组间喉部需氧/兼性厌氧菌的CFU无显著差异。先前研究发现喉部样本在厌氧培养条件下无菌落生长，表明喉部主要被需氧/兼性厌氧菌定植，因此本研究未进行厌氧培养。但需要承认的局限性是无法排除苛养/不可培养厌氧菌的存在。

通过16S rRNA基因测序进一步分析细菌多样性和群落结构。AB小鼠盲肠微生物群的前10个细菌属以及α和β多样性均发生显著改变。相比之下，喉部细菌前10个属的相对丰度仅轻微变化，AB小鼠喉部微生物群的α或β多样性未检测到显著变化。研究成功重现了抗生素处理对肠道微生物群的破坏，对盲肠微生物群的多样性和丰度产生显著影响。为进一步澄清微生物群对抗生素的反应并排除肠道微生物群的潜在混杂效应，对肠道和喉部样本分别进行主坐标分析（PCoA）。与先前观察一致，喉部微生物群基本未受处理影响。根据偏倚校正的ANCOM测试（ANCOM-BC），在属水平和其他水平均未检测到AB和CT小鼠喉部差异丰度；而以支原体科（Mycoplasmataceae）某个未知属为主的细菌群在AB小鼠盲肠中显著富集。这促使我们进一步研究喉部局部免疫特征，以探索肠道菌群失调可能带来的免疫变化。

Cell type heterogeneity in the larynx of AB-treated mice

新鲜收集8-10周龄雄性和雌性小鼠喉部，按组（CT或AB）混合后解离成单细胞悬液。使用高通量、基于液滴的平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。去除低质量细胞后，获得CT组40,373个细胞和AB组39,927个细胞进行后续分析。通过无监督的基于图聚类，然后使用CellKb进行细胞类型注释并基于经典标记物表达进行手动优化，在两组中鉴定出4个类别的23种 distinct细胞类型。

上皮细胞包括基底上皮细胞（BEC）、中间基底上皮细胞（iBEC）、基底层上上皮细胞（SBEC）、分泌上皮细胞（SEC）、纤毛上皮细胞（CEC）、簇细胞（TC，也称为刷细胞）、循环基底上皮细胞（cBEC）、柱状细胞（CC）和肌上皮细胞（MyC）。免疫细胞包括巨噬细胞（M）、树突状细胞（DC）、中性粒细胞（N）和淋巴细胞（L）。非上皮/免疫细胞包括成纤维细胞（F）和内皮细胞（EC），而杂类细胞包括软骨细胞（C）、肌细胞（MC）、施万细胞（SC）、骨骼肌细胞（SkMC）、周细胞（P）、平滑肌细胞（SMC）、淋巴管内皮细胞（LEC）和红细胞（RBC）。胸腺上皮细胞（TEC）可能来自喉部周围的残留胸腺组织，连同杂类细胞类型因其低代表性不在本研究讨论范围内。这些发现与我们早期对小鼠喉部细胞类型的研究一致。

尽管处理和未处理小鼠的细胞类型异质性高度相似，但我们观察到两组间几种细胞类型的比例存在显著差异。使用scCODA分析比较AB和CT小鼠各主要喉部细胞类型的细胞比例。在AB小鼠中，BEC、SEC、SBEC和F的比例显著降低，而中性粒细胞比例显著增加（FDR = 0.05）。主要细胞类型的无监督亚聚类显示两组中不同数量的亚型。在FDR为0.1时，细胞亚型的scCODA分析显示AB和CT小鼠细胞比例无显著差异。然而，在较宽松的FDR为0.3时，发现AB小鼠中成纤维细胞亚型4（F4）、巨噬细胞亚型4（M4）和SBEC亚型2（SBEC2）显著减少。

Gut dysbiosis extensively altered gene expression in the larynx

为研究肠道微生物群对喉黏膜在转录组水平的影响，我们比较了AB和CT小鼠喉部的转录组谱，使用保守的伪批量方法分析细胞类型和亚型。所有主要细胞类型的转录组受到肠道菌群失调不同程度的影响，其中免疫细胞（M和DC）、上皮细胞（SEC、SBEC和cBEC）和EC变化最为显著。

在巨噬细胞中，AB和CT小鼠之间有110个基因差异表达（avg_log2FC > 0.5，调整后P值 < 0.05）。其中，AB小鼠中上调的67个基因与生物过程相关，如细胞对含氧化合物的反应、细胞内信号转导的负调控、血管生成的调节、对LPS的反应以及蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节。相反，在相同阈值下，未鉴定出CT小鼠巨噬细胞中上调基因的显著Gene Ontology（GO）术语。同样，在DC中鉴定出42个差异表达基因（DEGs）。在AB小鼠中，上调基因与过程相关，包括对细胞因子刺激的反应、蛋白激酶B信号传导的调节、DNA模板转录的调节和病毒生命周期的调节。在CT小鼠中，上调基因与神经系统发育、细胞生长和分解代谢过程相关。

喉部非免疫细胞的转录组谱受到肠道菌群失调不同程度的影响，无论其远端解剖位置如何。在SEC中，AB和CT小鼠之间有84个基因差异表达。AB小鼠中上调的基因与上皮结构维持、对外部刺激反应的负调控和自噬体成熟相关。相反，CT小鼠中上调的基因与过程相关，如脂肪细胞分化的调节、突触修剪和上皮间质转化的调节。在SBEC中，有111个基因差异表达。AB小鼠中上调的基因与凋亡过程的调节、细胞群体增殖、多细胞有机体过程、白细胞趋化性和血管系统发育相关。相比之下，CT小鼠中上调的基因参与中间纤维组织、Ras蛋白信号转导和突触组织。

EC也对AB处理表现出显著反应。在AB小鼠中，参与过程的基因如跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路、DNA模板转录和整合素介导的信号传导在EC中显著上调。在CT小鼠中，与血管生成的正调控、内皮细胞迁移、白细胞介素-8产生和内皮细胞-基质粘附相关的基因上调。

Gut dysbiosis altered gene regulatory network in the larynx

细胞的转录状态由基因调控网络（GRN）控制，其中转录因子（TFs）和辅助因子协作调节靶基因表达。为更深入理解AB处理对喉部转录组的广泛影响，我们进行了单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）分析。该分析用于检查AB和CT小鼠间转录因子（TFs）及其靶基因（称为调节子，regulons）的调控网络差异。该方法有助于识别可能影响喉部关键细胞类型分化和功能的调节子。

我们评估了两组14种主要细胞类型中前10个调节子的活性（通过曲线下面积AUC评分量化）。我们鉴定出一组 distinct的调节子（约33-91个）为AB或CT小鼠独有，以及不同数量（约100-274个）为两组共享的调节子。活跃调节子及其作用在AB和CT小鼠间明显不同，调节子对AB处理的反应因细胞类型而异。

对于每种主要细胞类型，我们通过评估AUC评分进一步鉴定跨小鼠组的差异调节子，这些评分显示响应AB处理的显著变化（通过Wilcox秩和检验确定，avg_log2FC > 0.25，调整后P值 < 0.05）。鉴于免疫细胞（M、DC）、上皮细胞（SEC、SBEC和BEC）和EC对AB处理的转录反应最强，我们进一步分析和比较了两种条件下这些细胞类型的前5个调节子。以下调节子在AB小鼠多种细胞类型的前5个调节子中频繁出现：Etv4(+)、Irf3(+)、Hltf(+)、Mga(+)和Nfil3(+)。

具体而言，与细胞分化相关的调节子Etv4(+)的活性在AB小鼠的多种细胞类型中显著升高，包括BEC、SBEC、SEC、M和DC。一个密切相关的TF，Etv5，在AB小鼠的中性粒细胞中显示活性增加。值得注意的是，所有这些细胞类型（除DC外）的比例均响应AB处理而变化。Irf3(+)的调节子活性在BEC、SEC、M和EC中显著增加。同样参与细胞分化和增殖的Mga(+)调节子活性在AB小鼠的BEC、cBEC、SBEC和DC中显著升高。Hltf(+)是一个调节细胞周期G2/M转换并在细胞增殖和凋亡中发挥作用的调节子，在多种上皮细胞类型和成纤维细胞中显示活性增强。Nfil3(+)活性在AB小鼠的吞噬细胞（特别是M和DC）中增加。在EC中，Hoxd9(+)和Crem(+)调节子的活性显著升高。Hoxd9在调节对骨和软骨形成至关重要的形态发生通路中发挥作用，而Crem响应环磷酸腺苷（cAMP）信号调节基因表达，影响细胞增殖、分化和免疫反应。Hoxd9在调节昼夜节律中也特别重要，进一步强调了其在多种生理功能中的作用。

我们比较了各细胞类型跨小鼠组的调节子特异性评分（RSS）以确定调节子的细胞类型特异性。由于肠道菌群失调，AB小鼠主要细胞类型的前10个调节子与CT小鼠明显不同。即使相同调节子在两种条件下存在，也表现出不同的RSS评分。这一证据表明TF-靶基因共表达网络响应AB发生转变，且转录反应是细胞类型特异性的。

Gut dysbiosis altered cell-cell communication in the larynx

细胞间相互作用（CCI）推断领域正在迅速出现和扩展。细胞通过各种信号分子（如激素、细胞因子和神经递质）进行通信。CCI是细胞相互交换信号以协调其活动的过程，对维持宿主生物功能至关重要。在本研究中，我们通过识别配体-受体相互作用（LRI）对并在条件间比较它们，以检查每种细胞类型内的差异LRIs，推断了两组小鼠的CCI。

以细胞类型为中心的过表征分析显示，SEC、TC、CC、DC、N、SBEC和M之间的相互作用在条件（AB vs. CT）间显著变化。涉及来自SEC和TC的配体以及SEC、TC、EC、F、MyC、CEC、N和SBEC上受体的相互作用在AB小鼠中显著上调。相反，涉及来自DC、N和SBEC的配体以及SBEC、L、TC、M、CC和DC上受体的相互作用在AB小鼠中显著下调。值得注意的是，巨噬细胞的自分泌（自身）和旁分泌（其他细胞类型）相互作用在AB小鼠中均上调和下调，表明巨噬细胞可能是细胞间通信中受影响最大的细胞类型之一。因此，我们研究中识别的主要发射器和受体细胞类型是M、L、N、DC、SEC和SBEC。我们聚焦这些细胞类型以仔细检查它们的相互作用如何受到肠道菌群失调的影响。

为AB和CT小鼠中由主要发射器/受体细胞类型组成的每种细胞类型对识别了前三个差异活跃的LRIs。基于在这些主要发射器和受体细胞类型中识别的配体和受体基因的蛋白质-蛋白质网络分析，提供了配体和受体之间相互作用的概述。这些基因的功能富集分析揭示了与每种细胞类型中LRIs相关的 distinct生物过程。

在巨噬细胞中，LRIs与细胞增殖、迁移、对刺激的反应、细胞间通信、整合素介导的粘附和凋亡细胞清除相关。淋巴细胞相关的LRIs主要参与抗原呈递、细胞粘附、对外部刺激的反应和T细胞激活。中性粒细胞LRIs富集过程如细胞粘附、炎症反应、趋化性和细胞因子信号传导。树突状细胞LRIs与细胞迁移、免疫过程和分化相关。在SEC中，富集过程包括激酶调节、凋亡和对应激的反应，而在SBECs中，LRIs与对内源刺激和损伤的反应、整合素介导的粘附、上皮分化和TGF-β产生的调节相关。

DISCUSSION

本研究使用单细胞转录组学研究了AB诱导的肠道菌群失调如何影响喉部免疫功能。野生型、常规饲养的C57BL/6J小鼠接受2周抗生素方案饮水，导致肠道微生物多样性和群落结构发生显著改变，而喉部微生物群在观察窗口内变化很小。尽管如此，系统效应明显，肠道菌群失调对喉部产生广泛、细胞类型特异性的影响，改变细胞类型比例，并以细胞类型特异性方式重塑基因表达谱、基因调控网络和细胞间通信。我们的发现（此处及与我们先前研究结合）表明肠道和喉部微生物群共同塑造喉部免疫功能。

抗生素（如氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素ANMV）通常用于动物研究中破坏肠道微生物群。它们对宿主生理学的影响——细胞组成、信号通路和器官功能——已有充分记载。我们选择ANVM方案是因为其既定的治疗持续时间和易于给药。Josefsdottir等人应用类似方案探究微生物群依赖性造血功能，显示肠道微生物群耗竭后多系改变和多能祖细胞抑制。我们在C57BL/6J小鼠中重现了肠道微生物群破坏，观察到总细菌和相对细菌丰度、多样性和群落结构的显著转变。尽管不能排除抗生素对宿主细胞的直接毒性，我们的数据表明在此背景下直接效应最小：万古霉素和甲硝唑吸收差，主要作用于肠道，并且我们未检测到AB和CT组间线粒体或核糖体基因表达的差异或线粒体GO术语的富集。需要进一步研究以全面评估宿主反应。

AB诱导的肠道菌群失调显著改变了AB小鼠的细胞类型比例，增加免疫细胞——特别是中性粒细胞——并降低非免疫细胞（BEC、SEC、SBEC和F）比例。中性粒细胞的增加与在无菌小鼠中AB处理后系统部位髓系群体（巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞）减少的报道形成对比。相比之下，嗜碱性粒细胞前体可在AB处理后扩增，增加外周嗜碱性粒细胞和过敏反应。一些研究还报道AB处理小鼠淋巴细胞（B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞）显著减少，我们未观察到。这些差异可能反映了某些AB耐药肠道细菌的过度生长，这些细菌促进先天免疫招募、分化和运输。在我们的研究中，支原体科在治疗后主导肠道。该科成员（如支原体、脲原体）缺乏细胞壁，感染人类和动物，特别是在呼吸道。这并不罕见，因为抗生素方案施加选择压力 favoring耐药类群。AB相关感染通常涉及肠道和肠外器官（肺、肾和肝）中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。尽管喉部微生物生物量低，但共生菌似乎足以影响免疫力。因此，即使丰度降低到与喉部相当，重组肠道群落也可能影响循环免疫细胞水平，并间接影响喉部反应。同时，研究间在小鼠品系、饲养（饮食、饮水和住房）、AB方案（药物、剂量和持续时间）和细胞组成分析方法（scRNAseq、流式细胞术、IHC/IF）上的差异可能也导致不同结果和终点肠道谱。此外，循环肠道代谢物，如SCFAs，可能影响喉部上皮。尽管我们未在此测量SCFAs，先前工作显示SCFAs（丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐）可增强屏障功能并调节上皮细胞分化和增殖。因此我们推测改变的SCFAs可能与我们观察到的上皮分化和增殖减少（BEC、SEC和SBEC）以及支原体科过度生长相关，值得进一步靶向验证。

肠道微生物群对喉部转录组具有广泛影响。在AB处理小鼠中，肠道DEGs与对照相比 largely下调。在我们的研究中，处理和未处理喉部间每种细胞类型观察到显著数量的DEGs。如讨论，潜在驱动因素可能包括肠道微生物群的耗竭、存活AB耐药细菌的影响以及抗生素对宿主组织的直接效应。尽管我们未分析肠道基因表达，我们观察到的形态和生理变化与先前发现一致，表明肠道基因表达的变化可能影响喉部转录组。AB处理已知在组织中诱导氧化应激，可能通过线粒体应激或细菌杀灭增加巨噬细胞中活性氧（ROS）的产生。然而，在巨噬细胞或其他细胞类型的DEGs中未鉴定出线粒体基因。肠道菌群失调可能改变了免疫环境和巨噬细胞信号传导；例如，“对LPS的反应”在AB巨噬细胞中富集。尽管支原体科缺乏细胞壁，免疫激活可能由脂蛋白/脂聚糖引起，影响基因如Slpi、Nos2、Cd80、Adam9、Cd14、Cxcl3、Tlr4和Pf4。蛋白激酶信号传导也在巨噬细胞和树突状细胞中富集。鉴于激酶在免疫调节中的核心作用，这可能反映了更广泛的通路转变而非巨噬细胞特异性效应。尽管引人入胜，这些发现仍是相关的，应谨慎解释。

差异调节子可能在转录组水平塑造喉部基因调控。TFs—Etv、Irf3、Hltf、Mga和Nfil3—与其靶基因在主要细胞类型中的共表达表明肠道菌群失调驱动细胞类型特异性转录程序。Etv4（与Etv5）促进角质形成细胞分化、增殖和迁移。Irf3是关键的抗病毒TF，在SARS-CoV-2感染期间调节I型干扰素（IFN）反应。在巨噬细胞中，Irf3激活 distinct基因表达并诱导凋亡，通常与NF-κB和AP-1协调。Hltf参与细胞周期检查点、DNA修复和凋亡。Mga是影响MAX网络和T-box家族的双特异性TF。MAX网络涉及MYC和MXD/MAD蛋白，控制细胞增殖、分化、凋亡和代谢。Nfil3控制免疫谱系发育，如先天淋巴样细胞（ILC1,2,3）和T细胞（Treg, Th17），并与生物钟接口以影响代谢和细胞存活。 collectively，这些调节子汇聚于免疫和非免疫细胞的分化、增殖和凋亡通路，与观察到的细胞比例转变一致。值得注意的是，Etv4活性与上皮增殖一致，而Irf3和Hltf在我们的数据集中更多与成纤维细胞增殖相关。

肠道菌群失调可测量地改变了细胞间通信。跨细胞类型，富集过程包括整合素介导的细胞粘附、对刺激的反应、趋化性、凋亡和增殖。整合素受体（Itgα1,2,3,4,5,6,9、Itgβ1,2,3,5,6、Itgm、Itgv）是AB小鼠中前差异活跃LRPs之一。整合素介导的粘附是免疫防御和上皮完整性的基础。在免疫细胞中，它 enables内皮 transmigration和吞噬作用；在上皮细胞中，它 preserves组织 structure，促进伤口修复，并协调炎症。与这些作用一致，整合素信号传导在AB小鼠的EC中富集。与凋亡、增殖、趋化性和刺激反应相关的LRPs的更广泛富集与观察到的细胞比例转变一致，表明喉部调整信号网络以在微生物群破坏下维持稳态。

Conclusion

我们得出结论，AB诱导的肠道菌群失调对喉部产生 substantial、系统性的影响，特别是通过细胞类型特异性的细胞比例、基因表达、调控网络和细胞间通信在转录组水平的改变。尽管对喉部微生物群组成影响有限，但对喉部免疫调控和细胞相互作用的下游效应值得注意。这些结果强调了肠道-喉轴的重要性，并表明肠道微生物群可能在维持远端器官的免疫稳态和细胞功能中发挥关键作用。未来研究应探索肠道菌群失调对喉部健康的长期后果，并研究靶向肠道微生物群以调节喉部和其他远端部位免疫反应的潜在治疗方法。本研究突出了肠道和呼吸道健康