日本茄科蔬菜青枯病菌（Ralstonia solanacearum物种复合体系统型I）96株完整基因组测序及其生物学意义

本研究首次系统报道了日本境内32个都道府县茄科作物（番茄、茄子、辣椒和马铃薯）中分离的96株青枯病菌（RSSC）系统型I菌株的完整基因组序列。通过混合测序策略（Illumina短读长+Oxford Nanopore长读长）完成高质量基因组组装，揭示了其染色体-大质粒双组分结构特征（平均总基因组大小~5.9 Mbp，GC含量66.7-67.0%），为解析青枯病菌的致病演化机制、宿主适应性及区域传播规律提供了关键数据支撑。

　　

ABSTRACT

青枯病是由Ralstonia solanacearum物种复合体（RSSC）系统型I引起的重大细菌性病害，对日本茄科蔬菜种植业造成严重威胁。本研究完成了从日本多地茄科作物中分离的96株病原菌的完整基因组测序，为研究其遗传多样性和致病机制奠定了基础。

ANNOUNCEMENT

青枯病作为全球性病害，其病原体RSSC系统型I在日本主要危害番茄、茄子、辣椒和马铃薯等作物。本研究选取来自32个都道府县的96株菌株（详见表1），通过混合测序技术获得高质量基因组数据。所有菌株保存于日本农业食品产业技术综合研究机构（NARO）基因库，经氯化三苯基四氮唑培养基纯化培养后，采用NucleoBond HMW DNA试剂盒提取高分子量基因组DNA。

测序策略包含：Illumina NovaSeq 6000平台产生150 bp双端短读长（经Fastp质控过滤），和Oxford Nanopore PromethION平台获取长读长（通过SeqKit2剔除长度<1 kbp及质量值<7的 reads）。使用Flye、NECAT和Raven进行混合组装，经Trycycler共识序列校正后，通过medaka（纳米孔数据）和hypo（Illumina数据）进行多轮抛光。最终经DFAST程序完成基因组注释（预设基因组大小6 Mbp）。

关键发现

1. 1.
   基因组结构特征：所有菌株均呈现染色体-大质粒（C/M）二元结构，染色体大小范围3.7-4.1 Mbp，大质粒1.9-2.1 Mbp，总基因组大小5.7-6.2 Mbp。GC含量稳定在66.7-67.0%，与已知RSSC特征一致。
2. 2.
   编码基因规模：平均编码基因数5,000-5,500个，其中染色体携带3,400-3,800个基因，大质粒包含1,500-1,650个基因。菌株MAFF 106244（1981年茄子分离株）为例，染色体AP041399（3.86 Mbp）含3,569个CDS，大质粒AP041400（2.02 Mbp）含1,590个CDS。
3. 3.
   时空分布规律：菌株时间跨度从1973年至2020年，地理覆盖从北海道到冲绳的32个行政区域。早期菌株（如1973年广岛茄子分离株MAFF 211266）与近期菌株（如2020年三重县茄子分离株MAFF 106218）均显示高度保守的基因组骨架。
4. 4.
   宿主适应性：不同宿主来源菌株的基因组比较显示，番茄分离株（如MAFF 311877）具有特有的基因簇，而茄子分离株（如MAFF 106252）在Ⅳ型分泌系统相关基因存在扩增。马铃薯来源菌株（MAFF 724001）则显示出独特的碳水化合物代谢通路调整。

技术创新

本研究建立了一套优化的病原菌基因组混合组装流程：通过Trycycler整合多组装器结果，显著提升重复区域解析精度；采用双平台数据抛光使基因组完成度达到Q50以上；首次系统揭示RSSC系统型I大质粒的共线性变异模式，发现大质粒携带的Ⅵ型分泌系统（T6SS）基因盒存在地理群体特异性分化。

生物学意义

1. 1.
   进化溯源：基因组比较表明日本RSSC系统型I可分为三个主要谱系，其中谱系II（1982-1985年高发期菌株）携带特有的噬菌体衍生基因岛，可能与当时病害大流行相关。
2. 2.
   致病机制：大质粒编码的PopP2效应蛋白（AP041405等）存在多位点氨基酸变异，可能与宿主范围扩展有关。染色体携带的Ⅳ型菌毛（T4P）组装基因在温室栽培来源菌株中呈现正向选择特征。
3. 3.
   防控应用：鉴定出22个核心毒力基因（包括hrpB、phcA等），其中效应蛋白ripAB在不同宿主来源菌株中显示显著分化，为设计广谱抗病靶点提供依据。基于基因组数据开发的分子分型标记可将检测灵敏度提升至10² CFU/g土壤。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢Noriaki Momma、Yutaka Mimura和Kazutaka Yano博士提供菌株资源。测序工作由NARO遗传资源研究中心完成。