人类乳腺癌中SF3B1突变的独特与趋同效应：从临床队列到基因编辑模型的深度解析

本综述系统探讨了SF3B1热点突变在乳腺癌中的生物学与临床意义。研究通过构建等基因细胞系模型（CRISPR/AAV技术）和大规模临床队列分析，揭示了SF3B1突变（如K700E）通过诱导广泛转录组改变（如A3SS）、抑制细胞增殖并驱动拷贝数变异（CNV）的独特机制，为理解其 lineage specificity 和低变异等位基因频率（VAF）提供了新视角。

　　

Significance

在乳腺癌研究中，由于大型数据集中SF3B1突变患者数量有限以及缺乏经遗传定义的模型，SF3B1突变的临床影响和生物学效应一直未被充分探索。本研究通过创建包含最常见SF3B1热点突变的等基因乳腺癌细胞系面板，并结合迄今最大规模的SF3B1突变乳腺癌患者临床队列分析，全面评估了这些突变在分子、表型和临床层面的后果。

Abstract

肿瘤基因组分析发现了许多癌症驱动基因，但其在肿瘤生物学和治疗应用方面的意义仍研究不足。SF3B1的热点突变可诱导广泛的转录组改变，并存在于多种癌症类型中。尽管如此，SF3B1突变的生物学和临床后果仍然难以捉摸。对迄今最大SF3B1突变乳腺癌临床队列的特征描述发现，大约2.5%的HR+ HER2-乳腺癌中存在SF3B1驱动突变，其中K700E替换富集程度高，变异等位基因分数（VAF）差异大，并且由于在Luminal A型疾病中富集，总生存期显著改善。在代表性细胞模型中的体外和体内研究表明，几种最普遍的SF3B1突变对细胞生长具有有害影响，导致突变随时间推移被选择性丢失，这为乳腺癌中SF3B1突变频率低和VAF低提供了合理解释。尽管所有引入的热点突变都限制生长并随时间恢复为野生型（WT），但R625位点的突变比K700E表现出更显著的表型，这为临床观察到的突变频率偏差提供了解释。RNA和DNA测序分析用于识别SF3B1突变细胞中特征性的通路水平转录组变化，并确定拷贝数改变（CNV）既是提高突变耐受性的一种机制，也是随时间推移消除突变的一种手段。这些数据表明，虽然SF3B1突变在某些临床环境中富集，但它们在乳腺肿瘤发生中的作用高度复杂，并依赖于克服其对细胞生长和存活有害影响的次级事件。

引言背景

SF3B1突变广泛发生于实体和血液恶性肿瘤中，在大多数实体瘤（包括乳腺癌）中的频率为1%至5%，但在葡萄膜和粘膜黑色素瘤中可达20%以上。临床上，SF3B1突变是特征性基因组热点上的杂合事件。SF3B1的纯合突变或与其他剪接相关基因的共存突变被认为是合成致死的，这突出了该基因的必要性及其作为治疗靶点的吸引力。

SF3B1通过其在剪接体复合物内的协调作用，辅助3'剪接位点选择，并帮助稳定剪接体与前mRNA转录本之间的相互作用。在癌症中，SF3B1的热点突变具有功能获得性（change-of-function）活性，导致选择替代性3'剪接位点（A3SS）和富集替代性（也称为异常或隐性）mRNA转录本。这些隐性转录本中约有一半会经历无义介导的衰变（NMD），导致典型蛋白质的下调，而读框内（in-frame）的转录本可能翻译形成异常蛋白质。由于可变剪接的普遍性，与SF3B1突变相关的转录组变化涉及许多癌症相关通路，但对这些通路的利用尚未转化为临床 actionable 的靶点。

在过去十年中，虽然对SF3B1突变的一些作用有了更好的阐述，但其在乳腺癌中的功能和预后意义仍未 conclusive。一个尚未充分研究的领域是观察到的个体热点突变谱系特异性（例如，黑色素瘤中的R625，乳腺癌中的K700E）的生物学基础。虽然癌症中这种现象的病理基础尚不清楚，但在骨髓增生异常综合征（MDS）中，新兴证据表明个体SF3B1热点突变与临床特征相关，这强调了更好理解这一选择性过程的重要性。

目前我们对乳腺癌中SF3B1突变的了解受到临床数据集中代表性不足以及缺乏经遗传定义的人类SF3B1热点突变细胞模型的限制。

Results

The Clinical Landscape of SF3B1 Mutant Advanced Stage Breast Cancer.

由于公共临床数据集中SF3B1突变患者频率相对较低，定义其在乳腺癌中的临床景观和意义变得复杂。为此，在Tempus数据库中发现了420名患有SF3B1突变的乳腺癌患者（总频率为3.35%），变异被分类为致病性/可能致病性突变（P/LP或Driver）或意义未明变异（VUS）。与先前研究一致，该队列的亚型分析显示SF3B1突变在HR+/HER2-乳腺癌中富集，P/LP变异的总体频率为2.48%。当按分期分层时，SF3B1突变频率在III期和IV期HR+ HER2-疾病中更高（2.6%），而I期和II期分别为2.1%和2.2%。与先前发表的评估SF3B1突变乳腺癌的临床队列相比，该队列富含IV期患者，为晚期乳腺癌中SF3B1突变的景观增添了临床视角。

由于结构、功能和临床证据支持理解SF3B1中个体热点突变的重要性，评估了SF3B1热点突变的频率以更好地描述晚期乳腺癌中SF3B1热点突变的体细胞景观。K700E热点突变占所有P/LP SF3B1突变的84.86%。R625位点（C/G/H/L）的热点占队列的5.05%，其次是K666（E/N/Q）突变（2.29%）和K741E突变（1.38%）。所有其他突变的频率均低于1%。观察到的突变频率与先前发表的队列高度一致，表明K700E富集在乳腺癌各分期中是一致的。

由于SF3B1突变患者频率相对较低以及WT SF3B1功能的重要性，按乳腺癌亚型和分期评估了突变VAF。SF3B1突变的中位VAF为0.2。按分期分层时，IV期疾病的中位突变VAF（0.21）显著高于I-III期（0.15）。值得注意的是，突变VAF未超过0.5，这与先前报道的SF3B1突变纯合致死的观点一致。为了评估P/LP变异富集的特异性，比较了P/LP变异和VUS的VAF，发现在HR+, HER2-疾病中P/LP变异的VAF显著更高。

SF3B1突变已在几种癌症类型中显示具有预后意义；然而，SF3B1突变与生存之间的关联密切依赖于亚型和共突变谱，并且尚未在晚期乳腺癌中进行评估。为了更好地阐明SF3B1热点突变对临床结果的影响，分析了具有SF3B1 P/LP热点突变的HR+, HER2-乳腺癌患者（N = 82）与WT（N = 3,474）的真实世界总生存期（rwOS），发现SF3B1热点突变患者的rwOS显著改善。当按热点突变对生存进行分层时，K700E突变与WT相比显著改善rwOS，而其他突变则没有，尽管非K700E热点患者数量较少（n = 9）。

考虑到先前对早期疾病的研究已将PIK3CA共突变和Luminal B PAM50亚型与SF3B1突变设置下较差的预后相关联，评估了额外的协变量。首先，比较了HR+, HER2-乳腺癌中SF3B1 P/LP突变体与WT的共改变景观。在最普遍改变的基因中，TP53改变在SF3B1突变体中显著更不常见，考虑到TP53突变状态对患者结果的已知影响，这一点令人感兴趣。接下来，rwOS按TP53共突变以及先前确定的PIK3CA突变进行分层。与早期疾病中所见不同，无论是单独的SF3B1还是PIK3CA，或是两者组合，与双WT相比均未导致rwOS的显著差异，尽管单独SF3B1突变有改善rwOS的趋势。正如预期，单独的TP53突变导致显著更差的rwOS，而单独的SF3B1突变与双WT无显著差异。因此，SF3B1和TP53突变有限的共发生部分驱动了在整个队列中观察到的较好预后。为了二次验证这种关系，在cBioPortal中对ER+乳腺癌、所有乳腺癌以及精选的非冗余泛癌、黑色素瘤和急性髓系白血病研究中进行了SF3B1和TP53的 contingency 分析。在这些背景下，SF3B1和TP53是显著互斥的。此外，当通过创建一个对SF3B1、TP53和PIK3CA均为WT的对照组来考虑与TP53的互斥性时，在METABRIC队列的ER+样本中，SF3B1和PIK3CA的共突变并不会导致比WT组更差的生存，而当WT组未指定TP53状态时则会。

SF3B1突变也与Luminal B乳腺癌中较差的预后相关，因此接下来按PAM50亚型对队列进行分层。SF3B1突变在Luminal A疾病中显著富集，并且按PAM50亚型分层显示SF3B1突变体与WT的rwOS无显著差异。

总之，这些数据呈现了晚期乳腺癌中SF3B1热点突变景观的代表性概述，证明了K700E突变的持续富集以及晚期疾病中突变频率和VAF的增加。此外，虽然晚期乳腺癌患者的rwOS在SF3B1突变HR+, HER2-乳腺癌中得到改善，但这种关系归因于独特的共突变谱和Luminal A SF3B1突变疾病的主导地位。

Development of Isogenic Cell Lines With the Most Common SF3B1 Hotspot Mutations.

SF3B1突变临床景观的特征描述突显了可能 underlying SF3B1突变促肿瘤作用的复杂性，并强调了在其他模型系统中评估这些突变的必要性。与先前的临床研究类似，K700E热点突变在我们的乳腺癌队列中高度富集。相比之下，尽管R625替换构成了黑色素瘤中绝大多数SF3B1突变，但它们仅占我们突变乳腺癌队列的5%。这种 among 癌症类型的不对称分布的原因尚不清楚，但定义导致这种情况的选择压力可能为了解SF3B1突变在癌症中难以捉摸的作用提供 insight。

不同的SF3B1热点之间的转录组和表型关联尚未在乳腺癌的等基因系统中进行探索。为了解决这个问题，我们将几种最常见的热点突变，K700E、R625C和R625H，整合到最广泛使用的HR+乳腺癌细胞系MCF7和T47D以及非致瘤性MCF10A人乳腺上皮细胞系的基因组中。通过结合CRISPR和AAV策略，实现了在内源性SF3B1启动子下稳定整合杂合热点突变。编辑后，衍生出单克隆“pre-Cre”克隆，这些克隆整合了SF3B1突变和一个内含子抗生素选择盒，该选择盒阻止了突变等位基因的表达，导致暂时降低的SF3B1表达。“Post-Cre”克隆在Cre重组酶介导去除抗生素抗性盒后功能性表达突变等位基因。还使用具有WT同源臂的AAV生成了靶向野生型（TWT）细胞。这些细胞的生成代表了一个等基因细胞面板，将几种SF3B1热点突变引入多个HR+乳腺癌细胞系，尽管在T47D中生成所有热点在技术上受到其单克隆培养中生长缓慢的限制。这些模型使我们能够在生物学相关的环境中评估不同热点突变对致瘤特性的作用，并评估个体替换对转录组的影响。

Incorporation of R625 Mutations Is Not Tolerated in the Nontumorigenic MCF10A Cell Line.

SF3B1突变被认为是乳腺癌的早期事件，因此我们最初在未转化的细胞中评估了不同的SF3B1热点。有趣的是，在非致瘤性MCF10A细胞系中稳定整合SF3B1突变的耐受性因整合突变的位置而异。虽然K700E突变在我们小组先前的研究中被稳定引入，但R625C和R625H突变仅是瞬时耐受的。在电穿孔辅助转染和选择抗生素抗性单克隆集落后，建立了稳定的“pre-Cre”克隆并在新霉素选择下维持。去除抗生素抗性盒（导致突变功能激活（“post-Cre”）导致突变表达的快速丢失，并且无法在MCF10A背景中分离稳定的单细胞克隆。为了确定K700E突变是否是唯一允许的热点，我们使用相同方法在K666位点引入了一个突变。K666N热点被MCF10A稳定耐受，表明R625点突变在这种情况下可能具有独特的 deleterious 效应。

SF3B1 Hotspot Mutations Lead to Impaired Growth In Vitro and In Vivo.

考虑到特定热点突变在MCF10A中的有害效应以及先前报道的SF3B1与细胞生长之间关联的差异，我们接下来研究了个体热点突变对细胞生长的影响。在所有测试的细胞系（MCF10A, MCF7, T47D）中，杂合引入SF3B1热点突变导致细胞生长显著下降。为了在体内跟踪这些研究，我们使用SF3B1突变MCF7细胞在免疫缺陷、雌激素补充的 orthotopic 异种移植小鼠模型中评估了肿瘤形成和生长。一致地，所有MCF7 SF3B1热点突变细胞系在6周内表现出 diminished 肿瘤 engraftment 和显著更小的肿瘤。也尝试了T47D K700E异种移植，但无论SF3B1状态如何，肿瘤均未能生长。

一个悖论是，一个癌症相关基因的突变会阻碍致瘤性和非致瘤性细胞的生长，但类似地，增殖标志物MKI67在我们临床队列中HR+ HER2-疾病的SF3B1突变乳腺癌患者中显著较低，这是由于SF3B1驱动突变患者中Luminal A乳腺癌的显著富集。MKI67表达在癌症基因组图谱（TCGA）泛癌数据集中同样较低。总之，这些结果表明杂合SF3B1热点突变在体外和体内显著降低细胞生长，并且这些观察结果与患者样本中侵袭性较低的疾病特征相关得到支持。

Cells With SF3B1 Hotspot Mutations Are Selected Against Over Time In Vitro and In Vivo.

鉴于在体外和体内观察到的生长缺陷以及临床样本中VAF的广泛分布，通过微滴式数字PCR（ddPCR）定期评估培养细胞的突变VAF定量。经过10次传代，在所有引入MCF7细胞的SF3B1热点突变中观察到VAF下降。这种现象也发生在MCF10A和T47D细胞系中，但突变VAF丢失的时间框架要长得多。为了确定是否可以从这个WT回复群体中重新分离出突变单克隆，使用CellRaft AIR系统对传代编号5至7的MCF7突变克隆进行重新单细胞稀释，这使得能够 daily 可视化来自单细胞的集落生长。在96孔板阶段通过RT-PCR筛选集落，并在传代1时通过ddPCR定量突变VAF。虽然所有重新单细胞稀释的pre-Cre克隆以0.33或0.5的VAF保留了突变的存在，但来自post-Cre功能性突变体的单克隆的突变VAF范围从0到0.33，表明回复是一个早期事件。以0.5和0.33两种VAF分离pre-Cre克隆表明，WT SF3B1的早期重复存在，作为补偿一个等位基因基因 targeting 所引起的生长缺陷的一种机制。随后对具有最高突变VAF的克隆进行传代并再次跟踪，重新单细胞稀释的克隆同样回复为野生型，突变VAF在传代5时显著下降。

为了评估在体内是否存在对保留突变的细胞的选择劣势，通过ddPCR在肿瘤注射时和肿瘤终点定量突变VAF。对于所有引入MCF7的热点，在肿瘤终点时SF3B1突变VAF显著下降，而内源性PIK3CA E545K突变的VAF保持稳定。尽管T47D来源的肿瘤生长有限，但在终点观察到K700E VAF显著降低。此外，通过在免疫缺陷、雌激素补充的小鼠中进行 orthotopic 注射之前，将亲代T47D和T47D K700E克隆以50:50混合，测试了直接竞争对突变细胞保留的影响。引人注目的是，终点时的突变VAF几乎为零。

突变群体的丢失加上在引入突变的细胞系中观察到的 poor 生长表型表明，SF3B1热点突变在我们的模型中对细胞适应性具有 deleterious 后果，并可能为乳腺癌患者中相对较低的频率和低VAF提供合理解释。

SF3B1 Hotspot Mutations Lead to Widespread Transcriptomic Changes in Cell Models.

虽然SF3B1热点突变在这些模型系统中似乎是有害的，但在突变回复之前评估由SF3B1热点突变导致的转录组变化可能揭示细胞毒性的来源和/或确定SF3B1突变在致癌作用中的可能作用。由于K700E突变在HR+乳腺癌中的显著富集，我们试图通过 bulk RNA测序在我们三种细胞模型中与它们各自的对照相比，更好地定义K700E突变的转录组影响。尽管总体基因表达存在巨大差异，但我们发现了 hallmark 基因集富集的强一致性。此外，为了确定同一细胞背景内的热点是否具有独特和/或共享的转录组通路水平变化，我们评估了MCF10A中的K700E和K666N突变以及MCF7背景中的K700E、R625C和R625H突变。通常，观察到E2F靶点、G2M检查点、Myc靶点和氧化磷酸化的负富集，而炎症信号通路、凋亡和p53通路则出现正富集。总体而言，G2M检查点基因和E2F靶点的负富集与体外和体内观察到的表型一致。除此之外，Myc、NFκB和p53信号传导的趋同改变指向了SF3B1突变致癌作用的机制。

此外，使用两种独立方法ASCOT和LeafCutter研究了MCF7热点突变体中 alternative 剪接位点的使用。与先前的出版物一致，我们观察到所有突变中替代性3'剪接位点（A3SS）的使用富集。在评估个体样本时，存在一些具有最高 percent spliced in（PSI）的A3SS连接的热点特异性富集，但A3SS的层次聚类更明显地与突变VAF相关联，强调了SF3B1突变剂量依赖性的重要性。为了识别最重度差异剪接的转录本，评估了两种计算方法识别的转录本的PSI变化以寻求一致性。MCF7 K700E和R625C样本共享的 top alternative 剪接事件包括DLST、GCC2、TMEM14C和ENOSF1。

TP53 Mutations Are Significantly Less Common in SF3B1-Mutant Cancer but Comutation Does Not Result in Synthetic Lethality.

从我们的RNA测序中突出的通路来看，SF3B1与Myc和NFκB的关联先前已有报道，但与TP53的关系尚未探索。这些发现，加上SF3B1和TP53突变在多个数据集中的互斥性，表明两种突变可能具有共享的致瘤机制或导致合成致死。靶向合成致死关系已被建议作为剪接突变（包括SF3B1）的一种治疗策略，因此我们使用CRISPR-Cas9敲除MCF10A K700E突变体中的p53，发现双突变体是 viable 的。与此一致，T47D细胞具有内源性L194F p53改变，并且在该背景中引入SF3B1热点突变也被耐受。总之，这些数据提供了证据，表明SF3B1和TP53之间的互斥关系不是由于合成致死。相反，这种关系表明TP53和SF3B1突变在致癌作用中可能存在冗余或重叠的作用。

Mutant Cells Revert to WT Through a Copy Number Deletion but Retain Some Phenotypic and Transcriptomic Characteristics of Mutant Cells.

由于Rev WT细胞能够在异质群体中胜过突变细胞，我们接下来假设识别回复机制可以揭示细胞进化中的额外关键事件。为了评估Rev WT细胞，将混合群体重新单细胞稀释以分离保留突变的群体和Rev WT。尽管它们最终接管了混合培养物，但Rev WT克隆保留了在突变体中观察到的 poor 生长表型，无论是在体外还是体内。为了更好地理解这种表型和突变丢失的机制，对保留突变K700E的克隆和Rev WT克隆进行了全外显子组测序（WES）和RNA测序。

WES证明与K700E突变体相比，Rev WT样本中的突变（单核苷酸多态性和插入/缺失）数量和拷贝数变异（CNV）显著增加。获得的突变跨越多种生物学过程，但并未提供明确解释这种表型的突变事件。虽然突变的增加是显著的，但与在Rev WT克隆中观察到的CNV富集相比是 modest 的。值得注意的是，早期的K700E突变体与它们所衍生的pre-Cre克隆相比，并没有 substantially 增加的突变负担或CNV，表明基因组 alteration 的增加不太可能是单细胞稀释过程固有的克隆瓶颈的 artifact。

这些数据表明，随着SF3B1突变细胞系进化以消除突变，基因组事件显著增加。考虑到CNV的富集，我们进一步研究了SF3B1基因的拷贝数谱。毫不奇怪，Rev WT克隆有一个拷贝数缺失，确定了MCF7中回复的一种机制。有趣的是，在Rev WT样本中，基因组变化也与巨大的基因表达差异相耦合。尽管基因表达存在差异，但在应用基因集富集分析时存在惊人的相似性。当与亲代对照相比时，K700E克隆和Rev WT克隆都保持了与炎症反应通路、缺氧、TGF-β、NFκB、p53、凋亡、代谢通路和上皮-间质转化（EMT）相关的 hallmark 基因集的正富集。

相比之下，两组之间看到的最大富集差异涉及Myc靶点，其在K700E中显著负富集，但在Rev WT中相对于亲代对照显著正富集。Rev WT克隆的独特特征在于雌激素反应 hallmark 的正富集和有丝分裂纺锤体基因的负富集。有趣的是，Rev WT克隆不再显示在K700E突变体中观察到的E2F靶点和G2M检查点基因的负富集。

总之，这些数据表明SF3B1突变可能在非致瘤性和HR+乳腺癌细胞系中被瞬时耐受。虽然回复细胞在细胞培养中胜过杂合突变体，但它们相对于对照保留了负生长表型。先前的研究表明敲低SF3B1会阻碍生长，证实了在拷贝数缺失设置下生长不良是一致的。在分子水平上，Rev WT克隆似乎保持了杂合突变体的一些转录组特征，同时也在回复过程中进化以获得额外的改变。具体来说，Rev WT克隆保持了在突变体中看到的大部分炎症重编程，但它们使E2F靶点和G2M检查点基因的表达回归基线，并重新富集了先前去富集的Myc靶点。

由于观察到具有获得性SF3B1缺失的Rev WT克隆保持了在杂合突变体中观察到的 poor 生长表型，我们假设 poor 生长可能与突变表达诱导的WT功能丧失有关，而不是与突变本身有关。为了测试重新表达WT SF3B1是否会拯救这种表型，实现了SF3B1的 lentiviral 过表达（OE），并发现使细胞生长恢复到对照基线，支持了这一假设。

Discussion

虽然已经假设了SF3B1突变在癌症中的许多作用，但仍然很少有共识，尤其是在跨癌症类型中。在这项研究中，我们通过开发具有最常见SF3B1热点敲入突变的 comprehensive 等基因人类乳腺癌细胞系面板，并组装了最大的SF3B1突变乳腺癌患者临床队列，同时评估了SF3B1热点突变在乳腺癌中的分子、表型和临床后果。

我们的临床队列提供了独特的见解，因为其主要由晚期SF3B1突变乳腺癌组成。总体而言，随着疾病分期的进展，SF3B1 P/LP变异的频率和VAF增加，加强了SF3B1突变的致病表型。值得注意的是，I-III期疾病在该队列中代表性不足，这限制了早期和晚期疾病之间的明确结论，并支持在未来队列中需要进一步调查。在该数据集中，HR+ HER2- SF3B1突变乳腺癌患者的rwOS与WT相比显著改善。与此一致，我们还观察到SF3B1突变患者中MKI67的表达显著较低。对这些发现病因的调查强调，SF3B1对临床参数的影响与SF3B1突变在Luminal A疾病中的富集以及缺乏共存的TP53突变有关。这些发现共同将SF3B1突变乳腺肿瘤与侵袭性较低的特征联系起来。在研究临床数据集中的SF3B1突变时，一个引人注目的观察是 individual 热点突变的谱系特异性。重要的是，在骨髓增生异常综合征（MDS）中，最近的证据表明，按 individual 热点突变对SF3B1突变患者进行分层具有预后相关性。虽然我们看到与K700E突变的显著关系，但我们研究的一个局限性是非K700E热点突变的样本量低。随着数据集的不断增长，确定 discrete 热点的预后相关性将很重要。

与对癌症相关突变的预期相反，敲入最普遍的SF3B1突变导致体外和体内显著的生长缺陷。这种明显的劣势在未转化的MCF10A细胞中更加突出，其中R625密码子的敲入突变不被单克隆群体稳定耐受。这一发现支持了这样的假设，即观察到的谱系特异性与某些热点突变的缺乏耐受性有关，而不是富集的热点突变的优势，但一个显著的限制是MCF10A细胞是三阴性，并且缺乏任何可用的ER+非致瘤模型限制了我们创建最能代表临床景观的模型的能力。Canbezdi等人证明，异常剪接的程度既与突变密码子的位置有关，甚至与同一密码子内的氨基酸变化有关，与基线结构 charge 偏差越大，变化越剧烈。在他们的研究中，观察到R625H点突变诱导了测试突变中最大量的异常剪接，这可能解释了我们在未转化细胞中观察到的巨大适应性损害。虽然这种结构-功能关系可以解释为什么R625位点的突变在乳腺癌中不富集，但它并不能解释为什么其他不像R625突变那样强烈改变隐性剪接的热点在乳腺癌中也以低丰度存在，也不能解释为什么R625突变在黑色素瘤中如此高度富集。基于癌症类型对个体热点的富集和去富集的进一步探索仍然是一个未解答的问题，在未来研究中将这些突变引入额外的细胞谱系可能有助于澄清这一点。

此外，随着时间的推移，所有测试的癌细胞背景中的敲入突变最终都会丢失，其中最快速的丢失发生在MCF7细胞中。MCF7细胞在剪接异常的 stress 下通过拷贝数的变化而进化。虽然pre-Cre克隆在抗生素选择压力下保留了0.5的突变VAF，但去除抗生素选择和单细胞稀释导致出现突变VAF为0.33的克隆，表明WT SF3B1的重复。最大VAF为0.33表明拷贝数扩增提供了选择性优势，并且通过WES证实突变是通过拷贝数缺失丢失的。这种对WT表达的剂量依赖性进一步得到了 evidence 的支持，即在突变体和Rev WT设置中，通过 lentiviral OE of WT SF3B1拯救了生长表型。对WT SF3B1表达的依赖与过去确定SF3B1敲低导致生长缺陷的研究是一致的。尽管敲低模型不能重现热点突变的功能获得效应，但我们研究中观察到的生长缺陷可能通过引入突变时WT功能的丧失来解释。

除了我们工程化的