基于柔性金纳米粒子SERS胶带的志贺毒素变体快速无标记超灵敏检测与鉴别研究

本刊推荐：研究人员针对食源性致病菌产生的志贺毒素(Stxs)早期检测难题，开发了一种基于Kapton柔性基底的表面增强拉曼光谱(SERS)传感器。该传感器采用金纳米粒子(Au NPs)自组装技术，实现了对Stx1、Stx2及其酶切形式的高灵敏度检测(检测限达15 pM)和精准鉴别。这项研究为现场快速检测提供了新型技术平台，在食品安全和临床诊断领域具有重要应用价值。

　　

在全球食品安全和公共卫生领域，志贺毒素产生性大肠杆菌(STEC)感染一直是个严峻挑战。这类病原体产生的志贺毒素(Shiga toxins, Stxs)可引发出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征(HUS)等严重疾病，尤其对儿童健康造成巨大威胁。传统的检测方法如PCR、ELISA等虽然可靠，但需要专业设备、训练有素的操作人员以及较长的处理时间，难以满足现场快速检测的需求。更棘手的是，不同Stxs变体(如Stx1、Stx2和酶切Stx2)虽然结构相似，但致病性差异显著——Stx2与更严重的HUS发展密切相关，而酶切Stx2则通过激活补体系统参与发病机制。因此，开发能够同时实现高灵敏度检测和精准鉴别的新型传感技术迫在眉睫。

表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技术作为一种强大的分析工具，以其超高灵敏度、无需标记和实时分析能力而备受关注。特别是柔性SERS基底的兴起，为复杂环境中的分子检测开辟了新途径。这些柔性传感器能够适应不规则表面，与分析物高效相互作用，并在水性条件下工作，非常适合食品安全、环境监测和诊断等实时应用。在众多柔性材料中，聚酰亚胺薄膜(Kapton)因其优异的热稳定性、化学抵抗性和机械柔韧性脱颖而出，同时其固有的低拉曼背景有助于增强弱分析物信号的检测。

在这项发表于《Biosensors and Bioelectronics: X》的研究中，意大利应用科学与智能系统研究所的研究团队开发了一种基于Kapton柔性薄膜的金纳米粒子SERS传感器，专门用于Stxs的超灵敏检测和鉴别。研究人员采用简单的自下而上方法制备了这种传感器，通过马兰戈尼效应在两种不混溶液体界面形成金纳米粒子自组装单层(SAM)，然后将其转移到Kapton胶带上，形成金纳米粒子柔性胶带(GNPsFT)。

研究团队采用柠檬酸钠还原法合成金纳米粒子，通过扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)对纳米结构进行形态表征。使用4-巯基苯甲酸(4MBA)作为拉曼探针评估SERS增强因子(EF)，并通过主成分分析(PCA)进行光谱数据处理和毒素鉴别。毒素样品包括Stx1、Stx2和胰蛋白酶酶切的Stx2，分别在PBS缓冲液和人血清中进行测试，以评估传感器在复杂生物基质中的性能。

3.1. SERS基底表征

研究人员成功合成了尺寸均匀的金纳米粒子(平均直径37±4 nm)，并在Kapton胶带上形成了大规模的自组装单层。SEM和AFM分析显示纳米粒子分布均匀，没有明显聚集，形成了连续的纳米结构层，具有高密度的等离子体热点，这对于增强局部电磁场和提高检测灵敏度至关重要。

3.2. 金纳米粒子柔性胶带增强因子

使用4MBA分子评估SERS性能，结果显示在1079 cm^-1处的特征峰明显增强。计算得到的增强因子为6.9×10⁶，表明基底具有高灵敏度。三个独立制备批次的测试显示EF的批次间相对标准偏差(RSD%)为6.5%，平均EF为7×10⁶，证明了良好的重现性。

3.3. Stx2指纹图谱

SERS分析揭示了Stx2的独特光谱模式，在PBS中显示出一系列特征峰。500-540 cm^-1区域的谱带与二硫键相关，547 cm^-1处为色氨酸信号，657 cm^-1处为酪氨酸环变形，724 cm^-1处为甲硫氨酸C-S伸缩振动。1265 cm^-1处的显著峰归属于酰胺III α-螺旋模式，1141 cm^-1处的强带归属于C-N伸缩和CH弯曲。在人血清中也获得了基本一致的光谱指纹，尽管某些峰的强度和形状有所变化，但毒素的光谱模式没有显著改变。

3.4. 金纳米粒子柔性胶带的检测限

通过分析1265 cm^-1处酰胺III振动峰的强度，研究人员评估了传感器对Stx2的检测性能。结果显示SERS信号强度随毒素浓度增加而增加，在3-1047 ng/mL范围内呈现良好的线性关系。在PBS中计算的检测限(LOD)为15 pM，在人血清中为67 pM，这是迄今为止使用柔性SERS平台报道的该毒素最低检测限。重要的是，这些值低于或接近STEC感染患者粪便和血清中测量的临床相关Stx浓度范围。

3.5. 基于PCA的三种Stxs鉴别

传统方法难以区分毒素变体和异构体，因为它们可能共享氨基酸序列部分。研究人员利用制备的等离子体基底识别了三种Stxs的SERS光谱指纹。PCA分析成功将Stx1、Stx2和酶切Stx2区分开来，在PBS中前两个主成分分别解释了47%和38%的方差，在血清中分别解释了58%和16%的方差。尽管存在一些共享的光谱特征，但三种毒素的SERS谱在峰强度、形状和存在性方面显示出明显差异，如1419 cm^-1谱带为Stx2特有，而890和960 cm^-1峰在Stx1中缺失。

这项研究成功开发了一种基于Kapton柔性基底的SERS传感器，实现了对志贺毒素变体的超灵敏检测和精准鉴别。该传感器具有多项突出优势：极高的检测灵敏度(对Stx2的检测限达15 pM)；良好的批次间重现性(RSD%=6.5%)；能够有效区分结构相似的毒素变体；在复杂生物基质(如人血清)中保持性能；采用简单、成本效益高的自下而上制备方法。

研究的创新性在于首次将柔性SERS技术应用于细菌蛋白毒素的检测与鉴别，填补了该领域的空白。传感器性能优于许多传统检测技术(如PCR、ELISA)和其他新型策略(如LSPR、SPRi)，为现场快速检测提供了可靠平台。更重要的是，检测灵敏度与临床相关浓度范围相匹配，使得该技术有望应用于实际诊断场景，特别是在疾病早期阶段。

从应用前景来看，这种柔性SERS传感器可开发成集成微针的贴片，用于 minimally invasive 血液采样，实现临床环境中的快速点式护理诊断。在食品安全领域，该技术可用于食品表面污染的直接检测，无需复杂的样品前处理步骤。此外，该平台的设计理念和制备方法也可扩展到其他危险生物分子的检测，在环境监测、生物防御和医疗诊断等多个领域具有广泛的应用潜力。

这项研究不仅展示了柔性SERS技术在生物传感领域的巨大潜力，也为解决食源性疾病监测和临床诊断中的关键技术难题提供了创新解决方案，对公共卫生和食品安全领域具有重要意义。