探索人类精子核碱性蛋白与DNA之间的相互作用：六价铬是否可能起到干扰作用？

《Cerebral Circulation - Cognition and Behavior》：Exploring human sperm nuclear basic protein–DNA interactions: could hexavalent chromium play an interfering role?

人类精子核基础蛋白（SNBP）与DNA的相互作用在精子染色质组织化和生殖健康中起关键作用。本研究发现，六价铬（Cr(VI)）通过干扰精氨酸胍基与DNA的静电作用，导致SNBP聚集并显著降低其DNA结合能力。荧光光谱和SDS-PAGE分析证实Cr(VI)诱导SNBP构象改变和蛋白-DNA复合体稳定性下降。分子对接模拟显示，Cr(VI)还原生成的Cr(III)与精氨酸胍基形成稳定配位复合物，并特异性结合GC序列的鸟嘌呤碱基。去胍基化实验进一步验证了精氨酸在Cr(VI)毒性机制中的核心作用。这些发现揭示了Cr(VI)通过破坏SNBP-DNA相互作用导致DNA损伤的分子机制，为环境污染与男性生殖健康的关联提供了理论依据。

　　本研究围绕六价铬（Cr(VI))对人类精子核碱性蛋白（SNBP）与DNA结合能力的影响展开，揭示了Cr(VI)可能通过干扰SNBP的结构和功能，从而影响精子染色质的组织和人类生殖健康。SNBP主要包括两种类型的蛋白：约85%的原生质（protamines，如P1和P2）和约15%的组蛋白（histones）。其中，原生质在DNA结合过程中起着主导作用，主要通过其丰富的精氨酸（arginine）残基形成的盐桥（salt bridges）与DNA的磷酸骨架进行相互作用。然而，Cr(VI)的暴露被发现能够显著削弱这种结合能力，导致SNBP-DNA复合物的结构改变，并可能引发DNA损伤和染色质结构异常。

在实验设计上，研究人员采用了多种技术手段，包括电泳迁移率变动分析（EMSA）、SDS和原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）、荧光光谱分析（fluorescence spectroscopy）以及分子对接（molecular docking）模拟。通过这些方法，研究团队不仅观察到了Cr(VI)对SNBP结构的影响，还进一步探讨了Cr(VI)对SNBP-DNA复合物稳定性的影响。例如，在EMSA实验中，研究人员发现，Cr(VI)的处理显著降低了SNBP与DNA结合的效率，即使在较高的蛋白与DNA比例下也无法达到DNA饱和状态，这表明Cr(VI)可能干扰了SNBP与DNA之间的相互作用。同时，通过SDS-PAGE和Native-PAGE分析，研究人员发现Cr(VI)的处理导致了SNBP的聚集，这一现象可能与蛋白质结构的破坏或静电相互作用的干扰有关。

为了进一步探讨Cr(VI)是否主要通过精氨酸残基发挥作用，研究团队对SNBP进行了化学去精氨酸处理，将其转化为鸟氨酸（ornithine）。结果显示，去精氨酸处理后，SNBP的DNA结合能力显著下降，与Cr(VI)处理后的结果相似。这表明精氨酸在SNBP-DNA相互作用中具有关键作用。值得注意的是，当去精氨酸处理的SNBP与Cr(VI)共同处理时，DNA结合能力进一步减弱，说明Cr(VI)与精氨酸的相互作用可能具有协同效应，加剧了SNBP与DNA结合的障碍。此外，研究还使用了人工合成的多精氨酸（poly-l-arginine）和多赖氨酸（poly-l-lysine）作为模型蛋白，以验证Cr(VI)对精氨酸和赖氨酸的相对影响。结果表明，多精氨酸在Cr(VI)处理后表现出更强的DNA结合能力下降，这可能与其更高的电荷密度和更灵活的结构有关。相比之下，多赖氨酸的DNA结合能力受Cr(VI)的影响较小，表明Cr(VI)对精氨酸的结合能力具有更高的特异性。

在分子层面，研究团队利用AlphaFold 2预测了人类精氨酸丰富的原生质P1的三维结构，并通过HADDOCK 2.5进行了分子对接模拟，以探究Cr(VI)及其还原产物Cr(III)与SNBP及DNA的相互作用机制。结果显示，Cr(III)能够与精氨酸残基的胍基形成稳定的配位复合物，从而干扰SNBP与DNA的结合。这一机制不仅影响了SNBP与DNA之间的相互作用，还可能通过直接与DNA的鸟嘌呤碱基结合，影响DNA的结构稳定性。此外，研究还发现Cr(III)在GC富集序列中形成更为稳定的配位复合物，而在AT富集序列中则表现出较弱的结合能力。这种序列特异性可能与GC富集序列中碱基对的结构特性有关，例如鸟嘌呤的碱性较强，更易与Cr(III)形成稳定的相互作用。

进一步的荧光光谱分析表明，Cr(VI)的暴露改变了SNBP的极性表面暴露情况，使得荧光探针ANS（8-氨基-1-萘磺酸）的结合能力受到影响。ANS是一种对疏水性环境敏感的荧光探针，其荧光强度和发射波长的变化能够反映蛋白质结构的变化。在Cr(VI)存在的情况下，ANS的荧光强度显著降低，表明蛋白质的疏水性区域可能被遮蔽或结构发生了改变。这一现象进一步支持了Cr(VI)对SNBP结构和功能的干扰作用。此外，研究还发现，Cr(VI)的处理不仅影响了单独的SNBP结构，还对SNBP-DNA复合物的稳定性产生了影响，这可能是由于Cr(VI)改变了复合物的微环境，从而影响了其结构和功能。

实验结果还表明，Cr(VI)对SNBP的结合能力的干扰具有一定的浓度依赖性。当Cr(VI)浓度达到10 μM时，SNBP的结合能力显著下降，而在更高的浓度（如100 μM）下，这种干扰更加明显，甚至导致了蛋白质的聚集。这种聚集现象可能与Cr(VI)引起的蛋白质结构改变有关，而这些结构改变可能进一步影响SNBP在精子染色质中的功能。通过与去精氨酸处理的SNBP进行比较，研究团队发现，即使在没有Cr(VI)的情况下，去精氨酸处理的SNBP也表现出DNA结合能力的下降，这进一步强调了精氨酸在SNBP-DNA相互作用中的关键作用。当Cr(VI)与去精氨酸处理的SNBP共同作用时，DNA结合能力进一步减弱，这表明Cr(VI)不仅直接干扰了精氨酸的功能，还可能通过改变蛋白质的结构，间接影响其与DNA的相互作用。

此外，研究还探讨了Cr(VI)对DNA结合能力的潜在机制。通过分子对接模拟，研究团队发现Cr(III)能够与SNBP的精氨酸残基形成稳定的配位复合物，这些复合物可能通过静电作用或空间位阻效应干扰SNBP与DNA的结合。同时，Cr(III)还能够与DNA的鸟嘌呤碱基形成配位复合物，这可能进一步破坏DNA的结构，导致DNA损伤。这种机制与之前的研究结果一致，表明Cr(VI)在体内可能通过其还原产物Cr(III)对DNA产生毒性作用。

综上所述，本研究揭示了Cr(VI)对SNBP-DNA相互作用的干扰机制，强调了精氨酸在这一过程中的关键作用。Cr(VI)可能通过改变SNBP的结构，导致其无法有效结合DNA，从而影响精子染色质的组织和DNA的保护功能。这种影响可能进一步导致DNA损伤、精子功能异常以及男性生育能力下降。研究结果不仅加深了我们对Cr(VI)在生殖毒性方面的理解，也为相关环境和职业暴露的健康风险评估提供了重要的科学依据。此外，通过使用多精氨酸和多赖氨酸作为模型蛋白，研究团队进一步验证了Cr(VI)对不同氨基酸残基的结合能力差异，为理解重金属对蛋白质-DNA相互作用的影响提供了新的视角。这些发现对于保护生殖健康、减少重金属污染对人类生育能力的潜在危害具有重要意义。