综述：抗体药物偶联物中的旁观者效应：在肿瘤异质性中 navigating the fine line

《Critical Reviews in Oncology/Hematology》：Bystander effect in antibody-drug conjugates: navigating the fine line in tumor heterogeneity

本综述深入探讨了抗体药物偶联物（ADC）中的“旁观者效应”这一关键但未被充分探索的特性。文章系统综述了其作用机制（如可裂解连接子、疏水性载荷）、临床优势（如T-Dxd在HER2low肿瘤中的疗效）及潜在风险（脱靶毒性），并提出了优化策略（Fc工程、TME重塑），为ADC在肿瘤异质性背景下的精准治疗提供了重要见解。

　　

抗体药物偶联物中的旁观者效应：在肿瘤异质性中 navigating the fine line

摘要

抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates, ADCs）通过将单克隆抗体与细胞毒性载荷相结合，代表了靶向癌症治疗的变革性进展。ADC 的一个关键但尚未被充分探索的特征是旁观者效应（bystander effect），即释放的载荷无论靶抗原表达如何，都能扩散到邻近细胞。本综述综合了当前对该现象机制、临床意义和优化策略的理解。从机制上讲，可裂解连接子（cleavable linkers）、疏水性载荷（hydrophobic payloads）和内在化（internalization）对旁观者活性至关重要。然而，肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的特征——升高的间质液压力（interstitial fluid pressure）、结合位点屏障（binding site barrier, BSB）和缺氧（hypoxia）——限制了 ADC 的渗透。在临床上，具有旁观者效应的 ADC（例如曲妥珠单抗德鲁替康，trastuzumab deruxtecan, T-Dxd）显示出优于非旁观者 ADC（例如曲妥珠单抗埃坦辛，trastuzumab emtansine, T-DM1）的疗效。尽管有这些优势，旁观者效应也引发了关于脱靶毒性（off-target toxicity）和根据抗原表达不同而疗效可变的问题。例如，虽然旁观者效应允许载荷穿透 BSB 并增加杀伤范围，但像 ARX788 这样的非旁观者 ADC 在均质环境中可能提供相当的疗效且毒性降低。当前的见解强调需要平衡旁观者效力和靶标特异性，特别是在抗原密度低或空间分布异质的肿瘤中。未来的研究应关注三个关键领域：（1）量化体内旁观者贡献；（2）阐明 TME 因素（如缺氧和结合位点屏障）对载荷扩散的时空调节；（3）验证组合策略，包括 Fc 工程（Fc engineering）、内在化诱导（internalization induction）和 TME 重塑（TME remodeling），以最大化治疗指数（therapeutic index）。弥合这些差距将完善 ADC 设计范式，与精准肿瘤学（precision oncology）优化疗效同时最小化系统毒性的目标保持一致。

引言

细胞毒性化学物质近一个世纪以来一直是癌症治疗的基石。然而，它们的临床效用仍然受到系统毒性的限制，这既限制了药物选择也限制了剂量。例如，像依沙替康（exatecan）这样强效的细胞毒性药物由于剂量限制性毒性（dose-limiting toxicities）而在临床上不可行。几十年前引入的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）通过选择性靶向肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAAs）以诱导免疫介导的细胞毒性或抑制致癌信号，从而彻底改变了肿瘤学。尽管其安全性良好，但 mAbs 的疗效与靶抗原密度紧密相关。靶向人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）的单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab） exemplifies 这一局限性：虽然在 HER2 过表达（HER2-high）的乳腺癌中非常有效，但其在 HER2 表达异质或低（HER2-low）的肿瘤中的效用减弱。值得注意的是，HER2-high、HER2-low 和 HER2-heterogeneous 亚型分别占乳腺癌的 15–20%、50–55% 和约 34%，这使得大多数患者无法从 mAb 单药治疗中获得最佳效果。为了将 mAbs 的精确性与细胞毒性药物的效力相结合，抗体药物偶联物（ADCs）被开发出来。这些三方结构包括一个肿瘤靶向 mAb、一个化学连接子（chemical linker）和一个强效细胞毒性载荷（cytotoxic payload）。在与 TAAs 结合后，ADCs 经历受体介导的内在化（receptor-mediated internalization），随后连接子降解或选择性裂解以在细胞内释放载荷。这种设计使 ADCs 表现出比其游离载荷显著增强的抗肿瘤活性，同时保持对正常组织的安全性。例如，在敏感细胞系中，ADCs 与其载荷的 IC₅₀ 比率通常范围为 0.01 至 0.1，表明 ADCs 具有 10 至 100 倍 greater 的抗肿瘤效力，从而将其定位为一种高度有前途的治疗方式。ADCs 已经经历了三代优化的发展。第一代 ADCs（例如，吉妥珠单抗奥佐米星，gemtuzumab ozogamicin，于 2000 年首次获批）采用鼠源或嵌合抗体与酸不稳定的腙连接子（acid-labile hydrazone linkers）结合；然而，这些结构经历了过早的载荷释放和免疫原性，这导致了临床失败。第二代 ADCs（例如，维布妥昔单抗，brentuximab vedotin，2011 年；曲妥珠单抗埃坦辛，T-DM1，2013 年）采用人源化抗体并利用蛋白酶可裂解（protease-cleavable）或不可裂解连接子（non-cleavable linkers）以增强血浆稳定性。然而，使用随机偶联方法导致异质的药物抗体比率（drug-to-antibody ratios, DARs），从而限制了治疗指数。当代第三代 ADCs（例如，曲妥珠单抗德鲁替康，T-Dxd，2019 年）利用先进技术实现 uniform DAR 控制，以及新型载荷以提高治疗效果并减少毒性。这些进步拓宽了治疗窗口（therapeutic windows），增强了体内稳定性，并使得即使在 TAA 低表达的肿瘤中也能进行有效治疗。除了直接细胞毒性外，ADCs 还表现出一种高度特征化的机制，称为“旁观者效应”，其中 liberated 载荷渗透细胞膜以杀死邻近细胞，无论靶抗原表达如何。这种现象在使用可裂解连接子和疏水性载荷的 ADCs（例如 T-Dxd）中观察到，有望克服抗原异质性。虽然旁观者效应可能增强 ADC 疗效，特别是在具有异质 TAA 表达的肿瘤中，但关于其对脱靶毒性贡献的担忧仍然存在。此外，其在均质 TAA 表达肿瘤中的治疗相关性以及调节此效应的策略仍然 poorly defined。本综述讨论了两个关键问题：1）旁观者效应的机制；和 2）基于旁观者效应的最佳获益。

Section snippets

Mechanisms of bystander effect

一项开创性的临床前研究在使用 ADC 治疗携带 HER2 异质和 HER2 阴性肿瘤的小鼠中证明了旁观者效应。T-Dxd 有效消除了 HER2 异质肿瘤内的 HER2 阴性细胞，但不影响 HER2 阴性肿瘤。其他具有不可裂解连接子或低渗透性载荷的 ADC 仅选择性杀死 HER2-high 细胞。磷集成点成像进一步显示，T-Dxd 抗体主要定位于 HER2-high 细胞，而其载荷（德卢替康，deruxtecan）扩散到邻近的 HER2 阴性细胞，证明了旁观者杀伤。从机制上讲，旁观者效应需要三个关键步骤：ADC 内在化、连接子裂解和载荷扩散。首先，ADC 必须通过网格蛋白介导的内存作用（clathrin-mediated endocytosis）或其它途径被内在化。内在化速率受抗原丰度、抗体亲和力和受体周转率影响。内在化后，ADC 被运输到溶酶体，其中连接子被裂解。可裂解连接子，例如肽基（peptide-based）连接子（被组织蛋白酶 B，cathepsin B，裂解）和葡萄糖醛酸基（glucuronide-based）连接子（被葡萄糖醛酸苷酶，glucuronidase，裂解），促进有效载荷释放。相比之下，不可裂解连接子（例如，T-DM1 中的硫醚连接子，thioether linker）需要抗体完全降解才能释放载荷，从而限制旁观者活性。最后，释放的载荷必须扩散穿过细胞膜。疏水性载荷（例如，德卢替康，log P 为 3.2）比亲水性载荷（例如，T-DM1 中的美登素，emtansine，DM1，log P 为 2.6）更容易穿过脂质双层。此外，某些载荷（例如，依沙替康，exatecan）是外排泵（efflux pumps）如 P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）的底物，这限制了它们的胞外扩散。因此，设计具有高膜渗透性和低外排敏感性的载荷对于 potent 旁观者效应至关重要。

Regulation of bystander effect

增强旁观者效应可以显著改善抗原异质肿瘤中的瘤内药物渗透和疗效。虽然设计具有或不具有旁观者活性的 ADC 在概念上很简单，但实现强效旁观者效应同时保持高靶标特异性仍然是一个关键的临床挑战。

Clinical evidence on bystander effect

曲妥珠单抗埃坦辛（T-DM1），一种非旁观者 ADC，在 HER2-high 乳腺癌中有效，但在 HER2-low 亚型中显示有限活性。相比之下，曲妥珠单抗德鲁替康（T-Dxd）在跨 HER2 表达水平上表现出优异的临床结果。DESTINY-Breast03 3 期试验显示，在 HER2-high 转移性乳腺癌中，与 T-DM1 相比，T-Dxd 显著延长了无进展生存期（28.8 对比 6.8 个月；风险比，0.33）。在 HER2-low 乳腺癌中，T-Dxd 也诱导了显著反应，而 T-DM1 无效，突出了旁观者效应在抗原异质肿瘤中的重要性。然而，T-Dxd 与间质性肺病（interstitial lung disease）风险增加相关，这归因于德卢替康对肺组织中表达 HER2 的正常细胞的脱靶毒性。相反，像 ARX788（一种具有非裂解连接子和微管蛋白抑制剂载荷的 anti-HER2 ADC）这样的非旁观者 ADC 在 HER2-high 肿瘤中显示出与 T-Dxd 相当的疗效，但毒性更低，表明在均质 HER2 表达的情况下，旁观者效应可能不是必需的。这些发现表明，旁观者效应的治疗效用取决于肿瘤的抗原异质性程度。

Conclusion

旁观者效应代表了 ADC 的双重性：它增强了瘤内载荷分布但增加了脱靶毒性风险。当前研究强调了可裂解连接子、载荷疏水性、ADC 内在化和 TME 动力学在调节这一现象中的重要性。虽然具有旁观者效应的 ADC 在多种肿瘤中 exemplify 成功，但其作用仍然有争议，需要亚型特异性优化。未来的努力应专注于量化体内旁观者贡献，阐明 TME 对载荷扩散的调节，并开发组合策略以最大化治疗指数。

Critical View

基于关于 ADC 和旁观者效应的现有临床前和临床证据，作者为未来 ADC 开发、研究和临床应用提出了以下观点：

旁观者效应与毒性之间的权衡：旁观者效应允许载荷扩散 beyond 靶细胞，这可能导致脱靶毒性并 potentially 减弱直接细胞毒性。需要进一步研究以阐明旁观者效应对脱靶和 on-target 毒性的影响。

根据肿瘤异质性的患者分层：肿瘤应通过多重免疫组织化学（multiplex immunohistochemistry）或空间转录组学（spatial transcriptomics）进行抗原异质性表征。具有高异质性的肿瘤可能受益于具有强旁观者效应的 ADC（例如 T-Dxd），而均质肿瘤可能用非旁观者 ADC（例如 ARX788）更有效地治疗。

载荷和连接子工程的优化：未来的 ADC 应设计具有 tunable 旁观者活性。这可以通过工程连接子使其在 TME 中特异性裂解（例如，被在肿瘤中上调的酶如基质金属蛋白酶，matrix metalloproteinases, MMPs）或通过修饰载荷 log P 以调整膜渗透性来实现。

与 TME 调节剂组合：共同给药 TME remodeling agents，例如抗血管生成药物（anti-angiogenic drugs）或透明质酸酶（hyaluronidase），可以增强 ADC 渗透和 bystander 杀伤。

预测性生物标志物：应开发生物标志物以预测旁观者疗效。候选者包括抗原异质性指数、TME hypoxia 水平、以及外排泵表达。

Funding

这项工作由山东省自然科学基金青年项目（批准号 ZR2023QH461）和青岛市医疗卫生研究项目（批准号 2024-WJK074）资助。

CRediT authorship contribution statement

概念化：Yanhao Liu 和 Xiaotao Zhang。数据管理：Yiming Wang。形式分析：无。资金获取：Yanhao Liu。调查：无。方法论：Yanhao Liu。项目管理：Yanhao Liu 和 Xiaotao Zhang。资源：Yanhao Liu 和 Xiaotao Zhang。软件：Yiming Wang。监督：Xiaotao Zhang。验证：Yanhao Liu 和 Xiaotao Zhang。可视化：Yiming Wang。撰写初稿：Yiming Wang, Xi Cheng 和 Xuan Li。撰写审阅编辑：Yanhao Liu。

Declaration of Generative AI and AI-assisted technologies in the writing process

在准备这项工作的过程中，作者使用了 DeepSeek R1 以提高稿件的可读性和语言。使用此工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

Declaration of Competing Interest

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响报道的工作。

Acknowledgments

不适用。

Conflict of Interest

作者声明本综述是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。