MeJA诱导型转录因子GiMYB76通过调控GiCHS4促进甘草中Licochalcone A生物合成的机制研究

《The Crop Journal》：GiMYB76, a MeJA-inducible R2R3-type transcription factor, regulates licochalcone A biosynthesis in licorice ( Glycyrrhiza inflata)

本研究针对甘草特征性活性成分Licochalcone A（LCA）生物合成调控机制不明的科学问题，通过系统鉴定甘草R2R3-MYB转录因子家族，发现MeJA诱导型转录因子GiMYB76可特异性激活GiCHS4启动子，显著提升LCA合成，为甘草品质改良提供了关键靶点和理论依据。

　　

甘草作为传统中药宝库中的瑰宝，其活性成分一直备受关注。在三种药典收录的甘草属植物中，胀果甘草（Glycyrrhiza inflata）因其特有的Licochalcone A（LCA）成分而独具价值。这种黄酮类化合物不仅具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种药理活性，更在制药和化妆品工业中展现出广阔应用前景。然而令人遗憾的是，尽管LCA的商业价值日益凸显，其生物合成路径及调控机制却始终笼罩在迷雾之中，这严重制约了通过生物技术手段提高LCA产量的努力。

以往研究表明，茉莉酸甲酯（MeJA）作为植物激素信号分子，能够有效促进黄酮类化合物的积累，这一过程通常通过调控MYB等转录因子来实现。R2R3-MYB转录因子家族作为植物中最大的转录因子家族之一，尤其在黄酮类生物合成调控中扮演着关键角色。拟南芥中的AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111等亚组7成员被证实参与黄酮醇生物合成的调控。然而，这些认识是否适用于甘草中LCA的生物合成调控，仍然是一个待解的科学谜题。

为了解开这个谜团，研究人员首先证实了MeJA确实能够显著促进胀果甘草幼苗和发根中LCA的积累。通过HPLC分析发现，用100 μmol L^?1 MeJA处理12小时后，LCA含量开始显著上升，24小时后进一步增加。与此同时，总黄酮含量在处理6小时后即近乎翻倍，并保持稳定直至24小时。在发根体系中同样观察到类似趋势，MeJA处理6小时后LCA和总黄酮含量均显著增加。这些发现为后续研究奠定了坚实基础。

随着分子生物学技术的不断发展，科学家们能够更深入地探索植物次生代谢的调控网络。在这项发表于《The Crop Journal》的研究中，作者综合运用了转录组学、分子生物学和生物化学等多学科方法，系统研究了胀果甘草中LCA生物合成的调控机制。研究首先通过基因组挖掘鉴定了147个GiR2R3-MYB基因，并对其进行了系统分析。利用RNA-seq数据筛选出在根中高表达且受MeJA诱导的候选基因，最终通过功能验证确定了GiMYB76的关键调控作用。

关键技术方法包括：采用HPLC-MS技术测定LCA含量；通过RNA-seq和qRT-PCR分析基因表达模式；利用发根农杆菌介导的遗传转化获得过表达株系；应用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）全基因组范围筛选GiMYB76结合靶点；采用烟草原生质体瞬时表达系统进行启动子活性分析。所有植物材料均来自中国宁夏西北华农中心的试验田，种子由甘肃金裕康药业科技有限公司提供。

3.1. LCA can be induced by MeJA in G. Inflata

通过HPLC分析发现，用100 μmol L^?1 MeJA处理胀果甘草幼苗和发根后，LCA含量显著增加。在幼苗中，LCA含量在处理12小时后开始上升，24小时后进一步增加；而在发根中，处理6小时后LCA和总黄酮含量均显著提高。同时，RNA-seq分析显示多个LCA生物合成途径关键基因的表达受MeJA上调，包括11个CHS、1个CHI、2个F2H、6个AKR、3个OMT和4个PT基因。

3.2. Characterization of the MYB gene family in G. Inflata

研究人员从胀果甘草基因组中鉴定出147个R2R3-MYB基因，命名为GiMYB1-GiMYB147。这些基因编码的蛋白质长度在128-991氨基酸之间，分子量为14.69-109.16 kDa，等电点为4.34-10.62。亚细胞定位预测显示大多数MYB蛋白（145个）定位于细胞核中。系统进化分析将其分为28个亚组，染色体定位显示这些基因不均匀分布在8条染色体上。基因复制分析发现108个GiR2R3-MYB基因来源于片段重复，共鉴定出90个片段重复对。

3.3. Identification of GiMYB genes involved in LCA biosynthesis in G. Inflata

通过组织特异性表达分析，发现22个GiMYB基因在根中表达水平高于叶中。进一步分析MeJA处理下的表达模式，发现7个GiMYB基因（GiMYB12、GiMYB15、GiMYB32、GiMYB34、GiMYB76、GiMYB139和GiMYB145）受MeJA上调。系统进化分析显示GiMYB40、GiMYB76和GiMYB131与已知调控黄酮醇生物合成的MYB蛋白聚为一类。qRT-PCR验证发现只有GiMYB76受MeJA诱导，因此选择其作为调控LCA生物合成的候选基因。

3.4. GiMYB76 promotes the accumulation of LCA in G. Inflata

通过发根转化获得过表达GiMYB76的转基因发根系，发现三个独立转基因株系中GiMYB76表达水平显著高于对照。虽然生长表型无显著差异，但LCA含量在过表达株系中显著提高。亚细胞定位实验证实GiMYB76主要定位于细胞核中。

3.5. Identification of GiMYB76 targeted genes by DAP-seq

DAP-seq分析发现GiMYB76在全基因组范围内有大量结合位点，三个独立重复分别鉴定出7297至17879个结合峰。约60.24%-61.34%的峰位于启动子区域。共有3875个基因被鉴定为GiMYB76的潜在靶标。 motif分析发现一个高度保守的15bp结合 motif：[AT][GA][TG]T[AT]G[TG]T[AG][GA]。KEGG富集分析显示这些靶基因显著富集于植物激素信号转导、黄酮类生物合成、淀粉和蔗糖代谢等途径。

3.6. GiMYB76 binds to the promoter and activates the expression of GiCHS4

从21个GiCHS基因中筛选出4个既是MeJA诱导又是GiMYB76靶标的基因（GiCHS1、GiCHS2、GiCHS3、GiCHS4）。过表达株系中GiCHS1和GiCHS4表达显著上调。启动子活性实验证明GiMYB76能够激活GiCHS4启动子，GUS活性提高1.7倍，而突变W-box（CCAACTACCC） motif后激活作用消失。GiMYB76对GiCHS1启动子无激活作用。

3.7. GiCHS4 is involved in the biosynthesis of LCA in G. Inflata

获得过表达GiCHS4的转基因发根系，8个独立株系中GiCHS4转录水平显著上调。虽然生长表型无差异，但HPLC检测发现LCA含量显著提高，总黄酮含量和LCA异构体licochalcone C含量也增加，LCA生物合成中间体含量同样显著上升。

研究讨论部分深入分析了MeJA在次生代谢中的重要作用，指出MeJA作为植物应激反应中的保守信号分子，通过激活JA信号级联引起转录重编程， typically涉及JAZ阻遏蛋白的降解和MYB、bHLH、WRKY等下游转录因子的释放。这种调控框架在黄酮类代谢中尤为明确。

研究人员强调了R2R3-MYB转录因子家族在植物中的广泛分布和功能多样性，许多R2R3-MYB转录因子被报道调控植物特异性代谢物（如苯丙烷类、 glucosinolates和黄酮类）的生物合成。通过与其他植物的比较，发现胀果甘草中147个R2R3-MYB基因的数量少于大豆（264个）和紫花苜蓿（265个），但多于拟南芥（131个）和水稻（109个）。

最重要的是，该研究首次揭示了GiMYB76通过直接激活GiCHS4表达来促进LCA生物合成的分子机制。JA信号诱导转录因子GiMYB76的表达，进而激活GiCHS4的表达，合成LCA生物合成中间体，最终导致目标化合物LCA的积累。这是首个在体内证明LCA生物合成转录调控的故事。

该研究的科学意义在于不仅阐明了GiMYB76转录激活GiCHS4促进LCA生物合成的机制，而且为甘草的基础研究和相关产业发展提供了宝贵见解。GiMYB76作为提高LCA积累和甘草品质的遗传操作靶点，具有重要的应用价值。然而，完整的LCA生物合成途径仍不清楚，未来研究应着重鉴定LCA生物合成中的核心酶，并阐明GiMYB76是否直接或间接调控这些基因，从而厘清LCA生产的调控机制。