对羟基苯甲酸酯抑制人和大鼠11β-羟基类固醇脱氢酶2的机制研究：揭示皮质醇代谢干扰与构效关系及计算机对接分析

本研究系统评估了9种对羟基苯甲酸酯对人胎盘及大鼠肾脏11β-HSD2的抑制效力、作用模式、构效关系（SAR）及分子相互作用，揭示了长链对羟基苯甲酸酯通过混合抑制机制和下调HSD11B2表达干扰皮质醇代谢，为理解其内分泌干扰效应提供了关键见解。

　　

在现代生活中，对羟基苯甲酸酯（parabens）作为抗菌防腐剂被广泛添加于化妆品、个人护理产品和药品中。然而，这些化学物质潜在的“内分泌干扰”特性，特别是它们如何影响体内关键的激素代谢酶，一直是科学家和公众关注的焦点。其中，11β-羟基类固醇脱氢酶2（11β-HSD2）扮演着至关重要的“守门人”角色，它负责将活性皮质醇（cortisol）转化为无活性的皮质酮（cortisone），从而精确调控体内的糖皮质激素和盐皮质激素信号。如果这道“关卡”被破坏，就可能导致高血压、胎儿发育异常甚至代谢综合征等一系列健康问题。尽管已知某些环境化学物（如邻苯二甲酸盐和双酚类）能抑制11β-HSD2，但对羟基苯甲酸酯是否具有类似效应，其作用机制和结构规律如何，却仍是未知领域。

为了解答这些问题，来自温州医科大学第二附属医院麻醉与围术期医学科的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项深入研究。他们系统评估了9种不同结构的对羟基苯甲酸酯，揭示了它们如何以物种特异性和结构依赖性的方式干扰皮质醇代谢，并阐明了背后的分子机制。

本研究综合运用了酶动力学分析、细胞毒性及代谢检测（CCK-8/MTT法、HPLC-MS/MS）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、表面等离子共振（SPR）结合分析、分子对接模拟、构效关系（SAR）与三维定量构效关系（3D-QSAR）药效团模型构建以及ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质预测等关键技术方法。研究所用的人胎盘组织由温州医科大学第二附属医院提供（伦理批准号：2022-K-81-01），大鼠肾脏组织取自上海实验动物中心。

3.1. Paraben-mediated inhibition of human and rat 11β-HSD2

研究人员首先发现人和大鼠的11β-HSD2酶动力学特性存在显著物种差异。人酶的米氏常数（K_m）为21.3 nM，最大反应速率（V_max）为118.0 pmol/mg/min；而大鼠酶的K_m高出2.7倍（57.06 nM），V_max高出3.9倍（466.0 pmol/mg/min），表明大鼠酶与底物的亲和力较低但催化转换效率更高。抑制实验显示，对羟基苯甲酸酯的抑制活性强烈依赖于其烷基链长度。对于人11β-HSD2，C4-C9烷基链对羟基苯甲酸酯及苯基对羟基苯甲酸酯表现出显著抑制活性（效力排名：壬酯>庚酯>己酯>苯酯>丁酯），而短链（C1-C3）和苄酯则无活性。相比之下，大鼠11β-HSD2表现出更广泛的敏感性，C4-C9烷基链、苯基和苄基对羟基苯甲酸酯均具有抑制效应（排名：壬酯>庚酯>己酯>苄酯>苯酯>丁酯）。动力学分析表明，所有有活性的对羟基苯甲酸酯均表现为混合型抑制模式。表面等离子共振（SPR）结合实验进一步证实，抑制力最强的壬酯和较弱的丁酯与人类11β-HSD2的结合平衡解离常数（K_D）分别为3.38×10^?5 M和3.02×10^?3 M，且其K_D值均大于动力学抑制常数（K_i），提示它们可能作为变构抑制剂或通过置换辅因子发挥作用，而非直接竞争底物结合位点。

3.2. Paraben inhibition in BeWo cells

在人类胎盘绒毛膜癌细胞（BeWo细胞）模型中，浓度≤100 μM的对羟基苯甲酸酯在24小时内未显示显著细胞毒性。功能实验表明，丁酯、己酯、壬酯和苯酯在低浓度（≤1 μM）下即可显著抑制细胞内的皮质醇代谢，而庚酯则需要较高浓度（10–100 μM）才能产生可比效应，这揭示了其细胞穿透能力的差异。更重要的是，Western blot分析发现，庚酯（100 μM）和壬酯（10及100 μM）处理能下调HSD11B2的蛋白表达水平。这表明对羟基苯甲酸酯不仅直接抑制酶活性，还可能通过减少酶蛋白的合成来加剧对皮质醇代谢的长期干扰。

3.3. SAR and QSAR analysis of parabens against human and rat 11β-HSD2

构效关系分析揭示了抑制效力的关键分子决定因素。双变量分析显示，对羟基苯甲酸酯的脂溶性（LogP）和烷基链碳原子数（CN）与对两种物种酶的半数抑制浓度（IC₅₀）均呈强负相关，证实疏水性是驱动抑制 potency 的主要因素。研究人员进一步构建了一个高预测精度的3D-QSAR药效团模型（Hypo1，R = 0.8778）。该模型识别出两个疏水区（HY）、两个氢键受体（HBA）和一个氢键供体（HBD）是抑制活性的关键特征。实验验证与预测高度一致：抑制力最强的壬酯能匹配两个疏水区（拟合值Fit = 4.85），而抑制力最弱的丁酯仅匹配一个疏水区（Fit = 3.64）。

3.4. Molecular docking analysis of parabens with human and rat 11β-HSD2

分子对接模拟深入阐释了相互作用的分子基础。序列比对证实人和大鼠11β-HSD2的催化残基（Ser219, Tyr232-x-x-x-Lys236）高度保守。对接结果显示，底物皮质醇与酶形成三个氢键（Tyr232, Gly218, Asn167）。抑制力最强的壬酯与人酶和大鼠酶的结合自由能（ΔG）分别为-6.43 kcal/mol和-6.37 kcal/mol，其计算出的K_i值分别为22.66 μM和21.54 μM。它稳定地结合在NAD⁺辅因子结合位点附近（人酶：Gly89-Ser96；大鼠酶：Thr88-Gly95），主要通过氢键、范德华力和疏水相互作用结合，这为其混合型抑制机制提供了结构基础。其他对羟基苯甲酸酯也观察到类似的跨物种结合模式。

3.5. Drug metabolism and pharmacokinetics of parabens

ADMET性质预测为理解其毒理学行为提供了补充信息。关键发现包括：壬酯的溶解度低于其他同类物；丁酯的血脑屏障（BBB）穿透性高于壬酯、庚酯、己酯和苯酯；除壬酯外，其他对羟基苯甲酸酯均能抑制CYP2D酶；仅苯酯表现出潜在的肝毒性风险；所有对羟基苯甲酸酯均表现出良好的吸收特性；苯酯具有高血浆蛋白结合率（>90%）。

4. Discussion

本研究的重要结论在于，它首次系统地揭示了对羟基苯甲酸酯是人和大鼠11β-HSD2的有效抑制剂，其抑制效力具有显著的物种特异性和结构依赖性。烷基链长度和分子疏水性是决定其抑制强度的关键因素，长链衍生物（C7-C9）效力最强。它们通过混合型抑制机制发挥作用，可能结合酶-底物复合物和游离酶，并且SPR结果表明其可能通过变构机制或辅因子干扰起作用，而非直接竞争。值得注意的是，某些对羟基苯甲酸酯（如庚酯和壬酯）还能下调HSD11B2的蛋白表达，这意味着其对皮质醇稳态的干扰是多层次的。分子对接证实了这些化合物与NAD⁺结合位点的相互作用，而3D-QSAR药效团模型成功预测了其活性，突出了疏水相互作用的核心地位。物种间敏感性的差异（如大鼠酶对苄酯敏感而人酶不敏感）警示了在从动物数据外推至人类风险时需要格外谨慎。鉴于人类生物监测数据显示尿液中对羟基苯甲酸酯浓度可达2–3 μM，以及在胎盘中可能存在的蓄积效应，环境相关浓度的暴露可能足以干扰胎盘11β-HSD2的保护功能，从而对胎儿编程和长期健康构成潜在风险。该研究为了解对羟基苯甲酸酯的内分泌干扰效应提供了关键的机制见解，强调了其在干扰皮质醇稳态方面的重要性，并为未来基于结构的毒性预测和风险评估提供了科学依据。