肝脏硬度的空间异质性无法预测原发性硬化性胆管炎患者的临床结局

《Hepatology Communications》：Spatial heterogeneity in liver stiffness does not predict clinical outcomes in patients with primary sclerosing cholangitis

肝细胞癌早期模型构建及药物响应研究。通过引入不同致癌基因组合（如shp53+HrasV12、c-Myc+HrasV12）建立原代小鼠肝细胞癌变细胞系，结合3D生物打印技术（海藻酸钠-明胶生物墨水）构建三维肿瘤组织模型。结果显示：RAS驱动型细胞对铁死亡诱导剂RSL3敏感性最高（IC50=1.521 μM），而三维模型相比二维培养具有更强的化疗（DOX、顺铂）和靶向药物（索拉非尼、仑伐替尼、卡博替尼）耐药性，并成功模拟肝肿瘤微环境特征（如细胞增殖、上皮间质转化相关基因表达）。该模型为早期肝癌精准治疗研究提供了重要工具。

　　肝癌，尤其是肝细胞癌（HCC），是全球范围内最致命的癌症之一，其治疗难度和死亡率都极高。根据现有研究，肝癌的高致死性部分归因于其在早期阶段的诊断困难，全球仅有不到30%的患者能在早期被确诊，而晚期肝癌患者的五年生存率低于5%。HCC占所有原发性肝癌的90%，而胆管癌仅占10%。因此，深入理解肝癌的分子机制和早期发生过程对于开发早期诊断方法和预防性治疗至关重要。近年来，全基因组测序技术揭示了与HCC和胆管癌发展相关的多种基因突变，但目前仍缺乏能够明确这些突变在肝癌发生过程中作用的模型，尤其是关于不同突变组合如何形成肝癌细胞的机制仍不清楚。

为了克服这些挑战，研究人员开发了一种新的方法，通过在原代小鼠肝细胞中引入不同的癌基因组合，构建了模拟早期肝癌发生的细胞模型。同时，他们利用3D生物打印技术，结合明胶和海藻酸盐作为生物墨水，创建了更加精确的肝癌组织模型，以更好地模拟肿瘤的关键特征。这一方法不仅有助于更详细地研究特定癌基因在肝癌发生中的作用，还为药物筛选提供了可靠平台。此外，研究发现，3D模型相较于传统的2D培养显示出更高的化疗和靶向治疗耐药性，这为评估药物在体内的实际效果提供了更贴近真实情况的实验手段。

在研究过程中，科学家们首先通过一种两步的体内灌注方法从6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠中分离出原代肝细胞。随后，这些细胞在特定培养基中进行扩增，以维持其成熟肝细胞的功能。为了验证这些细胞是否保留了正常的肝功能，研究人员进行了多种功能检测，包括吲哚菁绿（ICG）的摄取、糖原储存、以及油红O染色等，以评估其脂质合成能力。结果显示，这些细胞在形态和功能上与正常肝细胞保持一致，为后续的癌基因引入和实验奠定了基础。

为了模拟不同的癌基因突变组合，研究团队通过病毒转染的方法将多种癌基因引入到原代肝细胞中。这些癌基因包括shp53、c-Myc、△N90-β-catenin、Hras^V12和c-Met等。通过这种方式，他们成功建立了六种不同癌基因背景的肝癌细胞系。这些细胞在形态上与正常肝细胞存在显著差异，例如细胞边缘变得不规则，细胞核与细胞质的比例增加，以及细胞核的增大和形态学变化。同时，这些细胞在表达肝细胞特异性标记物如Alb和Ttr方面显著降低，而在表达干细胞相关标记物如Sox9和Axin2方面则显著升高，表明其具有更强的干细胞特性。

为了进一步验证这些癌基因对细胞凋亡方式的影响，研究人员使用了RSL3这一诱导铁死亡的药物，测试了不同癌基因背景下的肝癌细胞对铁死亡的敏感性。结果显示，携带shp53和Hras^V12突变的细胞对RSL3最为敏感，而c-Myc和Hras^V12突变的细胞则表现出较强的抗铁死亡能力。这一发现表明，不同的癌基因组合会影响细胞对铁死亡的反应，从而揭示了肝癌细胞在不同基因突变情况下的治疗敏感性差异。

此外，研究团队还对不同癌基因背景下的肝癌细胞进行了药物敏感性测试，包括常用的化疗药物如5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂和多柔比星（DOX），以及靶向治疗药物如索拉非尼、仑伐替尼和卡博替尼。结果显示，携带shp53突变的细胞对DOX表现出更高的敏感性，而携带c-Myc和Hras^V12突变的细胞则对这些药物具有更强的耐药性。这表明，癌基因的组合对肝癌细胞的治疗反应具有重要影响，可能为个性化治疗策略的制定提供依据。

为了更真实地模拟肝癌的微环境，研究团队采用了3D生物打印技术，将原代肝癌细胞与生物墨水结合，构建了三维肿瘤组织模型。这些模型不仅保留了肝癌细胞的特性，还能够更好地再现肝癌组织的结构特征。通过调整生物墨水的成分比例，研究人员优化了模型的稳定性，选择了5%明胶和1%海藻酸盐的组合，以确保细胞在三维结构中的长期存活和功能维持。在这些模型中，干细胞相关基因如Lgr5、Sox9和Axin2的表达显著增强，同时上皮-间质转化（EMT）相关基因如Vimentin和Snai1的表达也有所增加，表明三维模型能够更真实地反映肿瘤细胞的生物学行为。

三维模型还表现出比传统2D培养更高的药物耐受性。在对DOX和卡博替尼的药物敏感性测试中，三维模型显示出更高的细胞存活率，这可能与三维环境中细胞增殖速率加快和干细胞相关基因表达增强有关。这些发现表明，三维生物打印模型在模拟肝癌的治疗耐受性方面具有显著优势，为药物筛选和治疗方案的优化提供了更可靠的实验平台。

在讨论部分，研究团队强调了肝癌发生过程中癌基因相互作用的重要性。由于癌基因通常协同作用，仅依靠基因数据难以准确识别驱动癌症发展的特定基因组合，因此需要通过机制研究来明确这些基因在癌症发生中的具体作用。此外，三维模型在保持细胞-基质和细胞-细胞相互作用方面具有独特优势，使得其能够更准确地模拟肿瘤微环境。相比传统类器官模型，三维生物打印技术允许研究人员精确控制细胞的空间分布和组织结构，从而实现高通量药物筛选。这一平台不仅具备良好的可重复性和可扩展性，还能够为基因驱动的药物发现提供前所未有的机会。

研究团队指出，这些发现对肝癌药物开发和精准医学具有重要意义。他们通过分析不同癌基因组合对药物敏感性的影响，揭示了肝癌细胞在不同基因突变情况下的治疗敏感性差异，为开发基于生物标志物的治疗方案提供了理论支持。同时，三维模型的构建为评估新型药物在早期肝癌中的效果提供了更接近人体环境的实验条件。然而，研究团队也认识到，虽然他们的小鼠肝细胞模型提供了重要的见解，但未来仍需在人类系统中验证其转化价值。他们计划将患者来源的肝癌细胞与关键的肿瘤微环境成分结合，以开发个性化的治疗策略。

综上所述，这项研究通过引入不同的癌基因组合，成功构建了多种模拟早期肝癌发生的细胞模型，并利用3D生物打印技术创建了更接近体内环境的肿瘤组织模型。这些模型不仅在形态和功能上与正常肝细胞有显著区别，还能够更准确地反映肝癌的治疗反应和耐药性特征。通过比较2D和3D模型的药物敏感性，研究人员发现3D模型在模拟真实肝癌组织方面具有更高的精确性和临床相关性，为肝癌的早期治疗研究和药物开发提供了有力支持。未来，随着技术的进一步发展和应用的拓展，这些模型有望在肝癌的精准治疗和个体化药物筛选中发挥更大的作用。