基于聚类分析的犊牛源乳酸菌抗肠道病原菌研究：为开发新型益生菌制剂提供策略

《Dairy Science and Management》：Calf-derived lactic acid bacteria as antimicrobial agents against enteric pathogens: a clustering approach

本研究针对新生犊牛腹泻（NCD）这一导致犊牛高发病率与死亡率的全球性问题，旨在评估22株犊牛来源的乳酸菌（LAB）益生菌菌株（包括唾液联合乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌和粪肠球菌）对五种肠道病原菌的抗菌活性。研究人员通过琼脂点种法和琼脂扩散法评估其抑制效果，并采用聚类分析筛选出具有广谱高效抗菌活性的菌株组合（如Group D）。结果表明，特定犊牛源LAB菌株能有效抑制病原菌生长，为开发替代抗生素、预防NCD的多菌株益生菌制剂奠定了坚实基础，对促进犊牛健康养殖具有重要意义。

　　

新生犊牛腹泻（Neonatal Calf Diarrhea, NCD）是集约化奶牛养殖中困扰养殖户的一大难题，它不仅导致犊牛高死亡率（出生三个月内可达20%），还引发体重下降、脱水、代谢紊乱、生长受阻等一系列问题，给全球奶业造成高达40%的经济损失。长期以来，养殖业依赖亚治疗剂量的抗生素来应对肠道感染和促进生长，但随之而来的抗菌素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）问题日益严峻，寻求安全有效的替代方案迫在眉睫。益生菌，这类有益微生物，因其能通过竞争性排斥或产生抗菌物质等机制抑制病原菌定植，成为替代抗生素的潜力股。其中，乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）是反刍动物营养中常用的益生菌类群，但其功效具有明显的菌株特异性。因此，从特定环境中筛选具有强效抗菌活性的乳酸菌菌株，对于开发针对NCD的精准益生菌制剂至关重要。为此，研究人员在《Dairy Science and Management》上发表了一项研究，旨在系统评估犊牛来源的乳酸菌的抗肠道病原菌能力，并利用聚类分析寻找协同增效的组合，为开发多菌株益生菌制剂提供科学依据。

为开展研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：研究团队从健康的萨希瓦尔牛和摩拉水牛犊牛粪便中分离出22株具有益生潜力的乳酸菌菌株（包括唾液联合乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌和粪肠球菌）。通过琼脂点种法（Agar spot assay）直接评估乳酸菌对五种常见腹泻病原菌（大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、伤寒沙门氏菌ATCC 14028、亚利桑那沙门氏菌ATCC 13314和蜡样芽孢杆菌ATCC 14569）的生长抑制能力。同时，采用琼脂扩散法（Agar well diffusion assay）检测乳酸菌无细胞上清液（Cell-free supernatant, CFS）的抗菌活性。最后，基于抑菌圈数据，利用欧氏距离（Euclidean distance）和平均连接聚类（Average linkage clustering）进行聚类分析，将菌株按抑菌谱相似性分组。

Agar spot assay

琼脂点种法结果显示，22株LAB的抑菌效果存在显著差异，抑菌圈直径范围在0至35毫米之间。其中，唾液联合乳杆菌RBL68对伤寒沙门氏菌和大肠杆菌、唾液联合乳杆菌RBL62和RBL12对亚利桑那沙门氏菌均表现出最强的抑制作用。相反，罗伊氏粘液乳杆菌E7对亚利桑那沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌均无抑制活性。其他一些菌株如唾液联合乳杆菌RBL26和RBL38也对特定病原菌无抑制作用，体现了抑菌活性的选择性。

Agar well diffusion assay

琼脂扩散法结果与点种法结果具有良好的一致性，证实了LAB分泌的代谢产物在抗菌作用中的重要性。例如，唾液联合乳杆菌RBL62对亚利桑那沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均产生明显的抑菌圈。唾液联合乳杆菌RBL68对大肠杆菌的抑菌作用最为突出。这些发现进一步支持了乳酸菌通过分泌活性物质发挥抗菌作用的机制。

Clustering of Lactic acid bacteria strains based on their antibacterial activity

聚类分析将22株LAB划分为四个具有不同抗菌特征的组别（Group A, B, C, D）。Group D包含14个菌株，对所有测试的病原菌均表现出最强大和广谱的抗菌活性，显著优于其他组。Group C的5个菌株也显示出广谱活性，但抑制强度低于Group D。Group B的2个菌株（唾液联合乳杆菌RBL38和RBL26）主要对伤寒沙门氏菌和大肠杆菌有选择性抑制。而Group A仅含罗伊氏粘液乳杆菌E7，仅对大肠杆菌有效。这种聚类方法有助于识别具有相似抗菌特性的菌株，为构建协同作用的多菌株益生菌组合提供了依据。

Discussion

讨论部分深入分析了LAB抗菌活性的可能机制。研究表明，乳酸菌产生的有机酸（如乳酸、乙酸）是其主要抗菌物质之一，它们能降低环境pH值，并以未解离形式穿透病原菌细胞膜，导致细胞内酸化和跨膜质子动力破坏。此外，乳酸菌还可能产生过氧化氢、细菌素（bacteriocin）、双乙酰、雷特林（reuterin）等多种抗菌化合物。例如，粪肠球菌SW28的抗菌作用可能归因于其产生的细菌素。研究观察到，乳酸菌的抑菌效果具有菌株特异性，这与不同菌株产生抗菌物质的种类和能力差异有关。无细胞上清液（CFS）的抗菌活性提示其含有的代谢产物在抑制病原菌方面扮演了关键角色，这为将来开发基于CFS的抗菌制剂提供了可能性。

Conclusions

本研究得出结论，成功评估了22株犊牛源乳酸菌对引起NCD的主要肠道病原菌的抗菌活性。研究发现这些菌株的抑菌效果具有菌株特异性，其中Group D菌株（如唾液联合乳杆菌RBL68、RBL62、RBL12等）表现出最强、最广谱的抑制作用。其抗菌机制主要与产生有机酸、过氧化氢和细菌素等有关。这些源自犊牛的强效LAB菌株为开发替代抗生素、预防NCD的多菌株益生菌制剂提供了宝贵的资源和有希望的策略。然而，其在实际养殖中的应用效果和潜力尚需进一步的体内研究来验证。