超越双核菌门：28S宏条形码技术揭示潮汐河口隐蔽真菌谱系的生态功能与生物地理格局

本研究针对海洋真菌研究中存在的引物偏好性和数据库缺口问题，通过多基因区域(18S/ITS2/28S)扩增子测序技术，系统评估了北美潮汐河口不同盐度梯度下真菌群落的组成与分布特征。研究发现28S引物组能有效捕获早期分化真菌(EDF)谱系(占OTU总数的51%)，包括壶菌门(Chytridiomycota)和虫霉门(Zoopagomycota)等功能类群；通过拷贝数标准化qPCR技术证实EDF在 brackish沼泽沉积物中具有更高丰度；ITS2分析则揭示了潜在反硝化真菌(如木霉属Trichoderma)的分布模式。该研究为海洋真菌生态功能研究提供了新的方法学范式，揭示了EDF在河口生态系统碳氮循环中的重要作用。

　　

在广阔的海洋生态系统中，真菌作为关键的分解者和养分循环驱动者，长期以来未能获得与细菌同等的关注度。这主要源于两大技术瓶颈：通用引物对真菌DNA的扩增效率低下，以及参考数据库中对早期分化真菌(Early Diverging Fungi, EDF)谱系的覆盖严重不足。特别是在潮汐河口这类盐度动态变化的过渡带，真菌如何响应环境梯度并参与生物地球化学循环，仍是微生物生态学中亟待破解的黑箱。

传统研究多依赖内部转录间隔区(ITS)引物进行真菌群落解析，但这种方法对双核菌门(Dikarya)以外的EDF lineages存在系统性低估。更棘手的是，由于真菌生物量在海洋环境中相对较低，基于shotgun宏基因组学的策略往往难以捕获足够的真菌序列。因此，开发能够全面捕捉真菌多样性、特别是EDF谱系的高灵敏度方法，成为深入理解海洋真菌生态功能的关键前提。

在此背景下，由Madeleine A. Thompson领衔的研究团队在《Environmental Microbiome》发表了创新性研究成果。他们以美国南卡罗来纳州的North Inlet-Winyah Bay河口系统为天然实验室，通过多基因区域(18S/ITS2/28S)的扩增子测序技术，结合拷贝数标准化的定量PCR(qPCR)验证，系统揭示了盐度和沼泽类型对真菌群落结构的塑造作用。研究不仅证实了28S大亚基核糖体RNA(LSU rRNA)引物在捕获EDF多样性方面的显著优势，还发现了这些"隐蔽"真菌类群在brackish(半咸水)沼泽中具有更高的绝对丰度，可能通过分解有机质和参与氮循环等途径，深度影响河口生态系统的功能。

研究团队采用了多管齐下的技术路线：首先通过515F-Y/926R通用引物组、ITS3mix/ITS4(ITS2区域)和LROR/LF402(28S区域)三组引物对48个沉积物和48个表层水样本进行扩增子测序；利用ZymoBIOMICS微生物标准品评估引物性能偏差；采用基于RDP分类器和系统发育树的方法对28S OTUs进行分类学注释；通过拷贝数标准化qPCR定量28S rRNA基因拷贝数并换算为基因组当量(GE)；使用FUNGuild进行功能预测；最后通过统计学分析(PERMANOVA、差异丰度分析等)解析环境因子与群落结构的关联。

研究结果呈现出丰富的层次性发现：

真菌群落组成因引物选择而异

通过ZymoBIOMICS标准品的验证实验揭示，28S引物组在反映真菌真实比例方面优于ITS2引物。环境样本分析进一步显示，通用18S/16S引物组几乎无法检测到真菌OTUs(仅占0.003-0.03%)；ITS2引物虽然检测到8,236个OTUs，但主要捕获双核菌门(Ascomycota和Basidiomycota)，对EDF谱系的覆盖率不足2.4%；相比之下，28S引物检测到的3,624个OTUs中，EDF占比高达51%，包括Chytridiomycota(22.7%)、Zoopagomycota(15%)、Blastocladiomycota(6.9%)等类群。

盐度梯度驱动群落分化

基于28S数据的权重Unifrac PCoA分析表明，盐度(p=0.001)、温度(R²=5.4%)、pH(R²=5.5%)和沼泽类型(R²=10.9%)显著影响真菌群落结构。盐沼(salt marsh)以子囊菌门为绝对优势类群(平均80%)，而brackish沼泽中虫霉门(23.8%)和壶菌门(21.5%)占比显著升高。差异丰度分析识别出32个关键OTUs，其中Basidiobolus(虫霉门)、Entophlyctis(壶菌门)和Diversispora(毛霉门)等在brackish环境中显著富集。

EDF在brackish沉积物中具有更高生物量

拷贝数标准化qPCR结果显示，brackish沉积物中真菌丰度(最高达2.9×10⁶ GE/g)显著高于盐沼沉积物(Kruskal-Wallis test, p<0.001)。通过FUNGuild功能预测，EDF主要承担腐生营养(saprotrophic)功能，可能参与植物残体分解、藻类寄生和花粉降解等生态过程。

发现潜在反硝化真菌

通过ITS2数据与已发表反硝化真菌序列的比对，研究检测到Trichoderma harzianum、Purpureocillium lilacinum等具有反硝化潜力的物种，其在沉积物中的相对丰度最高可达4%。这些真菌可能通过不完全反硝化过程贡献N₂O排放，暗示真菌介导的氮循环在河口环境中可能被长期低估。

这项研究通过方法学创新与生态学验证的有机结合，确立了28S LSU rRNA引物在海洋真菌研究中的优势地位。其核心结论表明：早期分化真菌(EDF)不仅是河口真菌多样性的重要组成部分，更在brackish环境中表现出更高的生物量和功能活性。这些长期被忽视的类群可能通过分解有机质、寄生藻类、以及参与氮转化等途径，深度影响河口生态系统的碳氮循环过程。

研究的深层意义在于提供了全新的研究范式：28S引物组与拷贝数标准化qPCR的结合使用，能够同时实现真菌类群的高分辨率鉴定和绝对定量，为未来研究海洋真菌的生态功能提供了可靠的技术框架。此外，发现的盐度-群落-功能关联模式为预测海岸带生态系统对盐度变化的响应提供了理论基础，特别是在全球变化背景下海平面上升和淡水输入改变导致的盐度格局变化情景中。

值得注意的是，研究揭示的真菌反硝化潜力对准确评估河口温室气体通量具有直接意义。传统上认为反硝化主要是细菌主导的过程，但本研究表明真菌可能贡献了相当比例的N₂O产生——这种气体的全球变暖潜势是CO₂的298倍。因此，在未来的河口氮循环模型中，需要将真菌反硝化纳入考量范围。

总之，Thompson等人的工作不仅填补了河口真菌多样性研究的空白，更通过方法学创新为海洋真菌生态学设立了新的标准。其发现的多重营养功能EDF类群重新定义了我们对河口微生物食物网的认识，强调这些"隐蔽"的分解者可能在维持海岸带生态系统功能和服务中扮演着比预期更为重要的角色。