利用同源重组修复功能实验对BRCA1意义未明变异进行致病性精准分类的研究

本研究针对BRCA1基因中意义未明变异(VUS)的临床分类难题，开发了基于同源重组(HR)修复功能实验的评估体系。研究人员通过两种互补的HR报告系统（HeLa-DR和HCC1937-HR细胞模型），对16个BRCA1 VUS进行了功能表征，发现5个变异（p.V11G、p.H888Y等）导致HR效率显著降低，被判定为致病性变异。该研究为VUS的临床再分类提供了关键实验证据，对遗传咨询和PARP抑制剂（Olaparib）个性化治疗具有重要指导意义。

　　

在遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征(HBOC)中，BRCA1基因的致病性突变显著增加个体患癌风险。然而，基因检测中发现的众多意义未明变异(VUS)给临床决策带来了巨大挑战——这些变异无法明确分类为致病性或良性，导致患者无法获得精准的风险评估和预防措施。目前，功能实验已成为解析VUS影响的关键手段，其中同源重组(HR)修复功能检测尤为重要，因为BRCA1蛋白主要通过HR途径修复DNA双链断裂(DSBs)来发挥抑癌作用。

为破解这一难题，来自西班牙萨拉曼卡大学的研究团队在《Breast Cancer Research》上发表了一项深入研究。他们选取了16个BRCA1 VUS，利用两种HR报告系统进行了功能分析：第一种是基于HeLa-DR细胞系的成熟方法，需要先沉默内源BRCA1再导入待测变异；第二种是本研究新开发的基于HCC1937乳腺癌细胞（本身不表达功能性BRCA1）的直接互补实验。两种方法结果高度一致，鉴定出5个HR功能缺陷的致病性变异（p.V11G、p.H888Y、p.G1201S、p.Q1395R和p.F1734L），其余11个变异HR功能正常，提示为良性。值得注意的是，p.H888Y和p.G1201S位于已知功能域之外，拓展了对BRCA1致病突变分布的认识。

进一步研究发现，这5个HR缺陷变异对电离辐射的敏感性存在差异：其中4个（p.V11G、p.H888Y、p.G1201S和p.F1734L）表现出显著辐射超敏性，证实了其DNA修复功能受损；而PARP抑制剂奥拉帕利(Olaparib)敏感性实验显示，仅p.V11G和p.F1734L变异细胞存在超敏反应，提示不同变异可能通过特定分子机制影响治疗反应，这对个性化治疗具有直接指导价值。

主要技术方法

研究采用两种同源重组修复报告系统：基于HeLa-DR细胞（需沉默内源BRCA1）和自主研发的HCC1937-HR乳腺癌细胞系（直接表达变异蛋白）。通过流式细胞术检测GFP阳性细胞比例评估HR效率；利用慢病毒载体构建稳定表达各变异的细胞系；通过Western blot验证蛋白表达；采用 Annexin V/PI 染色和流式细胞术分析电离辐射和奥拉帕利处理后的细胞凋亡。变异来源于萨拉曼卡遗传性癌症遗传咨询实验室2001-2022年间发现的42个VUS中仍被数据库列为未明确的17个变异（成功构建16个）。

Functional analysis of BRCA1 VUS by homology-directed recombination repair(HDR) assays

通过两种HR报告系统一致发现5个VUS（p.V11G、p.H888Y、p.G1201S、p.Q1395R和p.F1734L）显著降低HR效率，判定为致病性；其余11个VUS的HR功能与野生型无差异，支持良性分类。

Functional analysis of BRCA1 mutations and sensitivity to ionizing radiation and Olaparib

电离辐射敏感性实验证实p.V11G、p.H888Y、p.G1201S和p.F1734L变异导致DNA修复功能缺陷；奥拉帕利敏感性显示p.V11G和p.F1734L变异细胞存在超敏性，提示变异特异性机制可能影响PARP抑制剂疗效。

Generation of stable HCC1937-HR cell lines expressing BRCA1 variants

成功构建稳定表达各BRCA1变异的HCC1937-HR细胞系，Western blot验证蛋白表达，为后续功能研究提供可靠模型。

研究结论与意义

本研究通过严谨的功能实验体系，成功将16个BRCA1 VUS分为5个致病性和11个良性变异，为临床基因解读提供了关键证据。研究发现部分致病变异位于已知功能域之外（如p.H888Y和p.G1201S），提示需关注非经典区域的致病机制。尤其重要的是，不同致病变异对DNA损伤剂和PARP抑制剂的反应存在差异，如p.Q1395R虽损害HR但不导致奥拉帕利超敏，而p.V11G和p.F1734L则对两种治疗均敏感，这为未来个性化治疗策略提供了实验依据。该研究强调HR功能实验结合药物敏感性测试可作为VUS临床分类的有效工具，且实验周期可满足临床需求，对改善遗传咨询和患者管理具有重要应用价值。