Hentak源乙酰短小杆菌（Exiguobacterium acetylicum）：兼具益生与增香功能的双效菌株研究及其在功能性发酵食品中的应用前景

本研究针对传统发酵食品中微生物资源开发不足的问题，聚焦印度曼尼普尔传统发酵鱼制品Hentak，分离筛选具有益生与增香双重功能的菌株。研究人员通过16S rRNA测序鉴定出一株乙酰短小杆菌Exiguobacterium acetylicum FPIH1，该菌株在pH 2.0和0.5%胆盐条件下存活率分别达79.03%和88.37%，上皮细胞粘附率达93.5%，并能产生1-丁醇、庚烷等关键风味化合物。感官评价显示其发酵的酸奶和米酒评分显著提升（8.0±0.86和7.0±0.79）。该研究为开发兼具健康效益与风味增强功能的新型发酵剂提供了优质菌种资源，凸显传统发酵食品微生物资源的应用潜力。

　　

在追求健康与美味并重的现代食品工业中，传统发酵食品正成为挖掘功能性微生物的宝库。发酵作为一种古老的食品保存技术，不仅能延长保质期，还能提升营养价值、安全性和风味特性。近年来，随着研究发现特定发酵食品微生物具有调节肠道菌群、免疫功能和代谢健康的作用，从传统手工制品中筛选新型益生菌的研究日益受到重视。与此同时，现代消费者越来越青睐"清洁标签"食品，希望风味来自天然发酵而非合成添加剂。挥发性有机化合物（VOCs）——包括醇类、酯类、醛类、酮类和硫衍生物——主要由微生物产生，发酵过程中的菌株组成显著影响最终产品的感官特性。因此，寻找兼具强大益生特性和合成理想VOCs能力的微生物，成为开发同时提升产品风味和消费者健康的多功能发酵剂的战略途径。

印度东北部曼尼普尔的传统发酵鱼制品Hentak正是这种未被充分开发的微生物资源库之一。Hentak通过将晒干的淡水鱼（通常为Esomus danricus）与Alocasia macrorrhizos叶柄混合，经过自然日光发酵制成，完全依赖于原料和环境中的本土微生物群落。这一过程形成了一个复杂的生态位，其中的 resident 细菌既控制生化安全，又产生当地区域美食所珍视的特征性辛辣而诱人的香气。早期的培养依赖性调查发现，Hentak中的乳酸菌（LAB）属，如Lactobacillus、Enterococcus和Pediococcus，能够耐受胃肠道应激、抑制病原体并粘附上皮表面，这些都是关键的益生标志。同时，Hentak的独特风味可追溯至成熟过程中通过蛋白水解、脂解和氨基酸分解代谢产生的丰富VOCs矩阵。

尽管有这些内在潜力，对Hentak的系统性生物勘探仍然稀缺，同时结合益生评估和详细香气分析的研究几乎空白。此外，非LAB类群——尤其是适应鱼基底物的中度嗜盐物种——的潜在贡献大多被忽视。其中，Exiguobacterium属因其非凡的生态广度、应激耐受性和新兴的营养保健品应用而近期受到关注，但仅有零星报道将其与发酵食品联系起来。

为了填补这一知识空白，研究人员实施了一个从分离到鉴定的完整流程，针对Hentak微生物组中具有双重功能的菌株。三十六株细菌分离物经过生化检测（包括蛋白水解、脂解和碳水化合物发酵）筛选。通过酸和胆汁耐受性、自动聚集能力和上皮粘附评估益生潜力；通过16S rRNA测序确定分子身份；使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）描绘有潜力菌株在模拟乳制品和谷物发酵中产生的挥发性谱图；抗生素敏感性和体外致病性检测确保安全性合规。该研究报告了菌株Hentak/NA/5的发现，鉴定为Exiguobacterium acetylicum，它结合了强大的益生特性与合成一系列酯类、醇类和酮类的能力，显著提升感官品质。

这些发现将E. acetylicum Hentak/NA/5定位为一个新颖的、多功能的发酵剂候选，能够满足当代对健康导向、天然风味发酵食品的期望。通过阐明该菌株的双重益生和香气生成机制，这项工作也有助于更深入理解传统鱼发酵的微生物生态，并扩展了功能性食品生物技术所考虑的生物分类广度。该研究论文发表在《Annals of Microbiology》上。

研究人员采用了几项关键技术方法开展本研究。首先从印度曼尼普尔多个市场的Hentak样品中分离纯化细菌菌株，使用营养琼脂（NAM）和de Man-Rogosa-Sharpe（MRS）琼脂进行培养。通过形态学、生化特性（如革兰氏染色、IMViC试验、催化酶和氧化酶测试）和酶活检测（蛋白水解、脂解和碳水化合物发酵）初步表征菌株。安全性评估包括溶血试验、DNase活性和抗生素敏感性测试（Kirby-Bauer纸片扩散法）。益生特性通过酸耐受性（pH 2.0-4.0）、胆汁耐受性（0.5-2.0%）、NaCl耐受性（2-8%）、自动聚集能力和鸡嗉囊上皮细胞粘附 assay 进行评价。应用候选菌株作为发酵剂制备酸奶和米酒，并进行感官评价（10点享乐标度）。挥发性化合物通过GC-MS分析，使用乙酯萃取和BSTFA衍生化。分子鉴定通过16S rRNA基因测序和系统发育分析（MEGA X软件）完成。统计分析使用IBM SPSS Statistics进行ANOVA和Kruskal-Wallis检验。

Isolation and morphological characterization

从Hentak样品中分离出36株微生物菌株，通过形态和生化特性进行表征。其中15株（Hentak/NA/1至Hentak/NA/15）被鉴定为革兰氏阳性、杆状、催化酶阴性；11株（Hentak/NA/16至Hentak/NA/26）为革兰氏阳性、球状、催化酶阳性；10株（Hentak/NA/27至Hentak/NA/36）为革兰氏阳性、杆状、催化酶阳性。所有分离株均显示动力和37°C厌氧生长能力。15株具有LAB典型特性的分离株被选中进行进一步鉴定。

Enzymatic and Biochemical profiling

通过生化检测筛选风味产生微生物，15株菌株中仅有6株（Hentak/NA/1至Hentak/NA/6）对蛋白水解、脂解或碳水化合物发酵至少一种酶活或代谢活性呈阳性。这些菌株能发酵多种碳水化合物（葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露醇），且对吲哚、MR、VP、柠檬酸盐利用、催化酶和氧化酶检测均为阴性，表明微生物菌株之间存在潜在多样性。

Safety assessment

安全性评估显示，Hentak/NA/1、Hentak/NA/3和Hentak/NA/5为γ-溶血（非溶血性），无溶血活性；无DNase活性；抗生素敏感性测试中，Hentak/NA/5对所有测试抗生素（包括氧氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素、阿米卡星、新霉素、利奈唑胺、阿奇霉素、氨苄青霉素、亚胺培南和氯霉素）均敏感，无耐药性，符合益生菌应用的安全标准。

Probiotic characterization

益生特性表征中，温度耐受性测试显示Hentak/NA/5在32°C、37°C和40°C下生长百分比分别为32.3±2.25%、30.9±2.7%和56.8±3.15%（p<0.05），表现出最强的热耐受性。酸耐受性方面，Hentak/NA/5在pH 2、3和4下的生长百分比分别为79.03±1.68%、86.56±0.73%和97.48±1.18%（p<0.05），显示出优秀的酸抗性。NaCl耐受性测试中，Hentak/NA/5在2%、4%、6%和8% NaCl下的生长百分比分别为66.35±0.79%、74.38±1.09%、82.79±1.97%和87.93±0.67%，表明高盐适应性。胆汁耐受性方面，Hentak/NA/5在0.5%、1.0%、1.5%和2.0%胆汁下的生长百分比分别为88.37±1.48%、72.05±1.22%、63.99±0.23%和50.18±0.79%（p<0.05），显示出最强的胆汁抗性。自动聚集能力测试中，Hentak/NA/5在5小时达到22.87±1.0%，聚集能力最强。上皮细胞粘附 assay 中，Hentak/NA/5的粘附百分比为93.5±1.3%，显著高于其他菌株（p<0.05）。这些结果表明Hentak/NA/5具有优异的益生特性，适合作为益生菌候选。

Sensory Evaluation and Volatile Compound Analysis via GC-MS

感官评价显示，用Hentak/NA/5发酵的酸奶和米酒获得最高评分，分别为8.0±0.86和7.0±0.79（p<0.05），显著优于其他菌株。GC-MS分析揭示，Hentak/NA/5产生的挥发性化合物包括1-丁醇（贡献干性、 amyl- alcohol-like 香气）、庚烷（轻微甜味、果香）和草酸（尖锐、柠檬酸味），这些化合物共同增强了产品的芳香复杂性和风味平衡。未接种对照组几乎无峰值，确认VOCs由Hentak/NA/5特异性生物合成。

Molecular identification and phylogenetic analysis

通过16S rRNA基因测序，分离株Hentak/NA/5被鉴定为Exiguobacterium acetylicum strain FPIH1（GenBank登录号PQ471485.1）。系统发育分析（MEGA X软件，Weighbor算法，Jukes-Cantor核苷酸替代模型）显示，该分离株与E. acetylicum strain IAE172紧密聚类，自举值支持度高（>97%），确认了其分类学归属。

研究结论表明，Exiguobacterium acetylicum（Hentak/NA/5）是一个新颖的多功能微生物候选，兼具益生和增香特性。其来源于具有文化意义但未充分开发的发酵产品，突出了其生态新颖性。该菌株作为发酵剂的应用可以增强发酵食品的感官和健康促进品质，强调传统民族发酵作为食品生物技术创新储备的微生物丰富性。讨论部分指出，Exiguobacterium属虽然在食品发酵中研究不足，但其卓越的应激耐受性和酶活性在极端环境中得到认可；该研究首次报告其在发酵鱼系统中的应用，并提供其益生功效和风味产生潜力的全面表征。感官验证在模型食品系统（酸奶和米酒）中进行，支持近期呼吁扩大益生菌和功能性食品研究范围以包括非LAB属的建议。局限性包括需要体内验证和全基因组测序以确认安全性、毒力基因缺失和稳定性，这对于工业应用和监管批准至关重要。总之，这项工作为开发下一代功能性食品提供了有前途的微生物资源，结合了健康益处与增强的感官属性。