利用根癌农杆菌介导的CHV1-EP713低毒病毒cDNA异源表达诱导灰葡萄孢菌表型减毒及其生防潜力研究

本研究针对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病严重危害多种经济作物的生产问题，研究人员通过农杆菌介导的转化技术将板栗疫病菌低毒病毒CHV1-EP713的全长cDNA导入灰葡萄孢菌中，成功获得病毒表达的转化子。研究证实转化子中病毒RNA的复制与表达显著降低了真菌的生长速率、产孢能力和致病性，并改变了宿主的氧化应激反应。该研究为拓展低毒病毒在真菌病毒交叉类群传播中的宿主范围提供了新证据，对开发新型真菌病毒生物防治剂具有重要意义。

　　

在农业生产中，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是一种毁灭性病害，可侵染超过1000种植物，包括多种园艺作物、蔬菜及果树，造成采前和采后的重大经济损失。该病原菌具有广泛的寄主范围和强大的环境适应性，传统化学防治方法不仅易引发抗药性，还对环境与食品安全构成威胁，因此开发新型、可持续的病害控制策略迫在眉睫。

与此同时，在森林病理学领域，另一种病原真菌——寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)引起的板栗疫病曾对北美板栗林造成毁灭性打击。而研究人员在该菌中发现了一类特殊的病毒：低毒病毒(Hypovirus)，其中CHV1-EP713作为代表性毒株，能显著降低宿主的致病力，导致菌落形态变化、产孢减少、色素沉积异常以及毒力衰退，这一现象被称为“低毒现象”（hypovirulence）。这类病毒不具有细胞外传播阶段，其传播依赖宿主菌丝融合或孢子传播，因此其应用在很大程度上受到宿主范围的限制。

一个引人深思的问题是：能否将CHV1-EP713这类已知具有减毒功能的病毒跨物种导入其他重要的农业病原真菌中，从而拓展其生防潜力？灰葡萄孢菌与板栗疫病菌同属子囊菌门，尽管分类地位有一定差异（分别为Leotiomycetes和Sordariomycetes），但可能保留部分保守的分子机制。此外，灰葡萄孢菌已有成熟的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化体系，这为异源病毒基因的导入提供了技术可行性。

基于以上背景，本研究旨在通过农杆菌转化系统，将CHV1-EP713病毒的全长cDNA导入灰葡萄孢菌强毒株CCg55L中，评估病毒能否在非自然宿主中有效复制与表达，并探究其对真菌生物学特性及致病力的影响，从而为病毒介导的真菌病害防控提供新思路。

本研究主要依托以下几项关键技术方法：首先通过分子克隆构建了融合质粒p18-XH9，该质粒整合了来自pXH9的CHV1-EP713 cDNA序列及来自p18质粒的T-DNA区域，并利用根癌农杆菌LBA1126介导转化灰葡萄孢菌菌株CCg55L；通过潮霉素抗性筛选和TAIL-PCR鉴定T-DNA插入位点；利用RT-PCR、dsRNA纤维素层析及核酸酶处理验证病毒RNA的转录与复制；最后通过表型分析、离体叶片接种试验及DAB组织化学染色评估转化菌株的生长、产孢、致病力和寄主氧化应激反应。实验中使用的灰葡萄孢菌CCg55L分离自智利Thompson无核葡萄果实。

Transformation of Botrytis cinerea mediated by Agrobacterium tumefaciens

通过Sgfl酶切位点连接pXH9与p18质粒，成功构建重组质粒p18-XH9，并利用根癌农杆菌转化灰葡萄孢菌CCg55L，获得两株潮霉素B抗性转化子CCg55L-A2与CCg55L-K2，为后续病毒表达研究奠定基础。

Genomic insertion site of T-DNA

经TAIL-PCR及测序分析发现，T-DNA在转化子中的插入位点位于不同染色体：CCg55L-A2中插入假定蛋白基因BC1G_04546内，而CCg55L-K2中插入基因间区，排除了插入突变导致表型变化的可能性。

Detection of viral mRNAs in B. cinerea transformants

利用ORF-A和ORF-B特异性引物进行RT-PCR，在转化子中检测到病毒特异性mRNA，而在野生型中无扩增信号，证明CHV1-EP713在灰葡萄孢菌中已发生有效转录。

Purification and characterization of dsRNA

通过CF11纤维素层析从转化子中纯化得到约13 kbp的双链RNA条带，经核酸酶处理验证其dsRNA特性，该结果与CHV1-EP713病毒复制中间体相符，表明病毒已完成复制循环。

Phenotypic changes in transformed strains

与野生型相比，转化子菌落形态发生明显变化，呈现羽毛状边缘及深色同心环状结构；在MYA和King B培养基上，转化子菌丝生长速率显著降低，产孢量减少约50%，显示病毒表达引起发育性状的深刻改变。

Virulence bioassays and determination of reactive oxygen species(ROS) production on grapevine leaves

离体葡萄叶片接种表明，转化子所致病斑面积显著小于野生型，其中CCg55L-A2和CCg55L-K2分别比野生型减少62%和46%；DAB染色显示转化子感染组织中过氧化氢积累及附着胞相关氧化爆发点明显减少，表明其激发寄主免疫反应的能力下降。

本研究通过农杆菌介导的遗传转化成功在灰葡萄孢菌中表达了CHV1-EP713低毒病毒的全长cDNA，证明该病毒可在非自然宿主中完成复制与基因表达，并诱导一系列与低毒现象相关的表型变化：包括菌落形态改变、生长速率与产孢量下降、致病力显著减弱以及寄主氧化应答调控异常。这些变化与病毒在自然宿主板栗疫病菌中引起的表型高度相似，表明尽管存在一定的分类距离，灰葡萄孢菌仍具备支持hypovirus复制的分子机制。

研究成果具有多方面意义：在理论层面，证明了低毒病毒具有较宽的宿主适应性，为病毒—宿主共进化研究提供新模型；在应用层面，为拓展CHV1-EP713及其他低毒病毒作为生物防治剂的使用范围提供了实验依据，尤其为灰霉病的绿色防控提供了新策略。此外，该研究也凸显了农杆菌介导转化技术在真菌病毒学研究中的实用价值，为今后类似研究提供了技术借鉴。

当然，该研究尚未阐明CHV1-EP713在灰葡萄孢菌中具体的作用靶点与分子机制，例如是否与G蛋白α亚基（如bcg1基因）的表达调控有关，或涉及cAMP信号通路与氧化应激应答的干扰，这些将是未来研究的重要方向。总体而言，本研究为真菌病毒跨类群传播及其生防应用奠定了坚实基础，并彰显了 mycovirus 在植物病害可持续治理中的广阔前景。