染色体水平基因组组装与Oligo-FISH验证揭示塔斯马尼亚雪石龙子染色体模型

本研究针对石龙子科基因组资源匮乏的问题，通过PacBio长读长测序与Hi-C scaffolding技术完成了塔斯马尼亚雪石龙子（Carinascincus ocellatus）染色体级别基因组组装，并创新性应用Oligo-FISH技术一次性验证了15条染色体模型（包括易错配的微染色体）。该研究建立了高质量的石龙子基因组模型，为爬行动物性别决定、胎生进化等重大演化机制研究提供了关键资源，同时开发了可跨物种应用的基因组验证方法。

　　

在爬行动物演化研究领域，石龙子科（Scincidae）蜥蜴堪称自然界的"进化实验室"。这个包含超过1750个物种的大家族，在全球各种环境中蓬勃发展，展现出令人惊叹的多样性：从四肢健全到四肢退化，从卵生到胎生（viviparity），从环境依赖型性别决定到遗传型性别决定。然而令人惊讶的是，尽管石龙子具有如此重要的进化研究价值，它们的基因组资源却极度匮乏——目前仅有约1%的物种拥有基因组数据，远低于其他蜥蜴类群（如蜥蜴科的7.7%），更无法与鸟类和哺乳类（超过12%）相提并论。

这种基因组资源的缺失严重限制了科学家们探索石龙子重要进化特征分子机制的能力。正是在这样的背景下，塔斯马尼亚雪石龙子（Carinascincus ocellatus）逐渐成为进化研究的新兴模式物种。这种生活在塔斯马尼亚高原的小型胎生蜥蜴，已经有一个持续25年以上的长期监测项目，为研究发育可塑性、衰老、高海拔适应和性别决定等进化过程提供了宝贵数据。但是，缺乏高质量的参考基因组一直是深入研究的瓶颈。

为了解决这一难题，由Paul A. Saunders领衔的研究团队在《BMC Biology》上发表了最新研究成果。他们采用PacBio长读长测序和Hi-C scaffolding技术，成功组装了塔斯马尼亚雪石龙子的染色体级别基因组，并通过创新的Oligo-FISH（寡核苷酸荧光原位杂交）技术一次性验证了所有15条染色体模型的准确性，包括传统上容易出错的小染色体（微染色体）。

研究团队主要运用了以下几项关键技术：PacBio HiFi长读长测序（36×覆盖度）获得高质量序列数据；Hi-C染色质构象捕获技术（40×覆盖度）进行染色体尺度 scaffolding；基于RepeatMasker的重复序列注释；BRAKER3流程结合RNA-seq和蛋白质证据进行基因注释；创新的Oligo-FISH探针设计方法，针对15条染色体设计三色标记探针库；跨物种FISH杂交实验验证探针通用性。

基因组组装与注释结果

研究人员获得了1.51 Gb的高质量基因组组装，contig N50达到98 Mb，BUSCO完整性评估为97.7%。通过Hi-C scaffolding和手动染色体边界界定，成功将基因组组装成15条染色体模型（8条大染色体和7条微染色体），其中99.9%的序列都被锚定到染色体上。研究发现微染色体相比大染色体具有更高的GC含量（44.9-48.0% vs 42.6-44.8%）和基因密度，这与脊椎动物中的普遍规律一致。重复序列占基因组的46.34%，大多数染色体末端都检测到了端粒重复序列。基因注释预测了26,690个基因模型，对应31,312个转录本，其中62%有完整的RNA和/或蛋白质证据支持。

Oligo-FISH染色体索引验证

研究最具创新性的部分是利用Oligo-FISH技术对基因组组装进行独立验证。研究人员设计了三个寡核苷酸探针库，每个库包含针对14-15个染色体区域的近2000个寡核苷酸，分别用不同荧光染料标记（红色/绿色/黄色）。通过单次FISH实验，所有15条染色体都显示出预期的独特颜色模式，证实了基因组组装中染色体模型的准确性，包括传统上难以准确组装的微染色体。

跨物种分析

研究人员进一步测试了C. ocellatus探针在近缘物种中的适用性。结果显示，在分化时间约1800万年的同属物种Carinascincus metallicus中，探针杂交成功且颜色模式完全相同，表明这两个物种间没有发生重大染色体重组。然而，在亚科水平不同的Liopholis whitii中，杂交则未成功。通过生物信息学分析，研究人员发现探针序列在同亚科的Cryptoblepharus egeriae（分化约4300万年）中的比对率为10%，而在不同亚科的Tiliqua scincoides（分化约7500万年）中仅为2%，说明探针的跨物种适用性与物种间的进化距离密切相关。

这项研究的意义不仅在于提供了一个高质量的石龙子基因组资源，更重要的是建立了一种高效、可靠的染色体级别基因组验证方法。传统的基因组验证方法如遗传连锁图谱构建需要物种具有短世代时间且易于人工繁殖，而BAC-FISH（细菌人工染色体荧光原位杂交）则需耗费大量时间和劳力。Oligo-FISH技术克服了这些限制，探针直接根据基因组组装序列设计，无需额外的遗传或细胞遗传数据，且可并行合成，避免了BAC-FISH所需的克隆和筛选步骤。

研究表明，虽然Oligo-FISH的分辨率可能低于遗传图谱或BAC-FISH，但其简单性、时间效率、成本效益和广泛适用性大大补偿了这一不足。特别值得注意的是，通过精确靶向独特序列，Oligo-FISH特别适用于重复序列含量高或多倍体物种的染色体 mapping，这些物种的染色体分析通常被认为具有挑战性。

研究人员还展示了Oligo-FISH探针在跨物种研究中的潜力。探针不仅在近缘物种中成功杂交，通过生物信息学分析还能揭示不同物种间的染色体共线性（synteny）和重排情况。这种将原位杂交和生物信息学分析相结合的方法，为检测染色体重排和探索染色体进化模式提供了有前景的研究途径。

该研究建立的塔斯马尼亚雪石龙子高质量基因组组装，解决了石龙子科基因组资源严重不足的问题，为后续的进化生物学研究提供了坚实基础。通过整合Oligo-FISH染色体索引，研究人员展示了一种有效的染色体模型外部验证方法，特别适用于解决与非哺乳动物脊椎动物中常见的微染色体相关的模糊Hi-C信号。

这种方法的建立对提高基因组组装的准确性具有重要意义，特别是对于那些具有高重复序列含量或多倍体等挑战性的基因组，从而增强了它们在下游分析中的适用性。研究人员建议，未来可以通过使用一个或多个附加探针库并用额外荧光染料（或荧光染料组合）标记探针来增加分辨率（每个染色体的位点数量），从而提高检测染色体内组装差异的能力。

总之，这项研究不仅为石龙子科和更广泛的爬行动物进化研究提供了宝贵的基因组资源，还建立了一种可推广的基因组验证方法，有望在未来基因组学研究中发挥重要作用，特别是在那些传统方法难以应用的非模式生物中。