基于内质网应激的基因调控网络分析构建急性髓系白血病预后模型

《Discover Medicine》：Integrated multi-omics profiling develops a prognostic model based on endoplasmic reticulum stress in acute myeloid leukemia

为解决急性髓系白血病(AML)预后差、异质性高的问题，研究人员开展了基于内质网应激(ERS)的预后模型研究。该研究通过单细胞测序(scRNA-seq)和基因调控网络(GRN)分析，识别出与ERS相关的关键模块，并构建了一个包含MPO、HOPX等7个基因的预后特征。该特征在多个队列中验证有效，并整合为列线图，其5年总生存期(OS)预测的AUC达0.798，为AML的精准预后分层提供了新工具。

　　

急性髓系白血病(AML)是成人中最常见的急性白血病，其特点是骨髓中未成熟髓系细胞的恶性增殖。尽管近年来在分子靶向治疗方面取得了一定进展，但AML的预后依然严峻，尤其是老年患者，5年生存率仅为15-20%。更棘手的是，即使处于相同风险分层的患者，其预后也可能天差地别，这背后是肿瘤细胞巨大的异质性和复杂的基因调控网络(GRN)相互作用。因此，开发能够整合多维数据、更精准预测预后的新模型，对于指导AML的个体化治疗至关重要。

内质网(ER)是细胞内负责蛋白质合成、折叠和修饰的关键细胞器。当细胞遭遇缺氧、营养缺乏等压力时，内质网内会堆积大量错误折叠或未折叠的蛋白质，从而引发内质网应激(ERS)。为了应对这种压力，细胞会启动未折叠蛋白反应(UPR)来恢复内质网稳态。然而，持续或过度的ERS会从促生存转向促凋亡，与多种疾病的发生发展密切相关。近年来，越来越多的证据表明，ERS和UPR与AML的发生、发展、预后及耐药性密切相关，这使其成为一个极具潜力的预后标志物和治疗靶点。

为了深入探索ERS在AML中的临床意义，孙晓丽和付汝宁的研究团队在《Discover Medicine》上发表了一项研究。他们巧妙地利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)和批量RNA测序数据，系统性地构建了一个基于ERS的AML预后模型。该研究不仅揭示了AML中内质网应激的细胞异质性，还开发了一个包含7个关键基因的预后特征，并最终整合临床数据构建了高精度的列线图，为AML的精准预后分层提供了新的工具。

关键技术方法

研究人员首先从GEO数据库获取了12名AML患者和2名健康供者的骨髓单细胞RNA测序数据，并利用Seurat软件进行质控、整合和细胞亚群注释。随后，他们应用单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)技术，重建了AML与正常骨髓细胞之间的基因调控网络(GRN)，识别出关键的转录因子模块。通过GSDensity这一图形模型计算工具，他们量化了每个细胞中ERS通路的活性得分，并据此将AML细胞分为高、低ERS活性组。通过差异表达分析，筛选出与预后相关的基因，并利用LASSO和逐步Cox回归分析，在GSE37642队列中构建了预后特征。该特征在GSE106291、GSE71014和TCGA-LAML三个独立队列中进行了验证。最后，研究人员整合风险评分和临床特征，构建了预测总生存期(OS)的列线图，并利用C指数、校准曲线和决策曲线分析(DCA)评估了其性能。

研究结果

1. AML骨髓与正常骨髓中的基因调控网络

研究人员整合了来自12名AML患者和2名健康供者的骨髓单细胞RNA测序数据，共包含19,397个细胞。通过SCENIC分析，他们识别出344个具有统计学意义的调控子(regulon)，这些调控子能够有效区分不同的细胞类型以及AML与正常骨髓细胞。通过无监督聚类，研究人员将这些调控子划分为8个主要模块。其中，M4模块在AML骨髓细胞中表现出最显著的差异活性。基因富集分析显示，M4模块主要富集在内质网应激、细胞粘附、细胞因子产生、白细胞迁移和T细胞活化等生物学过程中，提示内质网应激可能是AML中一个关键的调控通路。

2. 单细胞转录组中的内质网应激相关基因特征

为了进一步聚焦内质网应激，研究人员将M4模块的靶基因与GeneCards数据库中的“内质网应激基因”进行交集分析，最终确定了314个ERS相关基因。利用GSDensity技术，他们计算了每个细胞的ERS活性得分，发现AML骨髓细胞的ERS活性显著高于正常骨髓细胞，并且这种高活性在未分化祖细胞、髓系细胞、淋巴系细胞和红系细胞中均普遍存在。根据中位得分将AML细胞分为高、低ERS活性组后，差异表达分析鉴定出71个显著差异表达基因(DEGs)。基因集富集分析(GSEA)显示，高ERS活性组中，补体信号、上皮-间质转化(EMT)和干扰素-γ反应等免疫炎症通路被激活，而MYC靶点、G2/M检查点控制和E2F介导的增殖程序等细胞周期调控通路则被抑制。

3. 利用批量转录组数据构建并验证内质网应激相关预后特征

为了将单细胞层面的发现转化为临床可用的预后工具，研究人员利用上述71个差异表达基因，在GSE37642队列中构建预后特征。通过单变量Cox回归、LASSO回归和双向逐步Cox回归分析，最终筛选出7个关键基因：MPO、HOPX、CST3、ITM2A、CD96、IFITM1和SPINK2。其中，HOPX、IFITM1和SPINK2为风险因子，而MPO、CST3、ITM2A和CD96为保护因子。根据这7个基因的表达水平计算风险评分(RS)，将患者分为高风险组和低风险组。生存分析显示，高风险组患者的总生存期(OS)显著缩短。该特征在GSE71014、TCGA-LAML和GSE106291三个独立验证队列中均表现出稳健的预后预测能力，其预测5年总生存期的曲线下面积(AUC)均超过0.7。

4. 免疫细胞浸润分析及免疫学相关性评估

为了探索该预后特征背后的免疫学机制，研究人员利用CIBERSORT算法评估了高风险组和低风险组之间免疫细胞浸润的差异。结果显示，单核细胞在低风险组中显著富集。相关性分析进一步发现，保护因子CST3的表达与单核细胞呈强正相关，而与调节性T细胞(Treg)呈强负相关，提示CST3可能通过调节单核细胞相关的免疫功能发挥其保护作用。

5. 整合临床特征建立并评估列线图

为了进一步提高模型的临床实用性，研究人员整合了风险评分和临床特征，构建了一个预测总生存期的列线图。单变量和多变量Cox回归分析均证实，风险评分和年龄是AML患者的独立预后因素。该列线图在预测1年、3年和5年总生存期方面表现出色，其AUC值分别达到0.720、0.786和0.798。校准曲线显示，列线图的预测概率与实际观察概率高度一致，决策曲线分析(DCA)也证实了其具有更高的临床净获益。

结论与讨论

本研究通过整合单细胞和批量转录组数据，系统性地揭示了内质网应激(ERS)在急性髓系白血病(AML)中的关键作用。研究发现，M4调控模块在AML中高度活跃，且主要富集于ERS通路。基于此，研究人员构建了一个包含7个关键基因(MPO、HOPX、CST3、ITM2A、CD96、IFITM1和SPINK2)的预后特征，该特征在多个独立队列中均能有效区分患者预后。其中，HOPX、IFITM1和SPINK2被鉴定为风险因子，而MPO、CST3、ITM2A和CD96则作为保护因子。免疫浸润分析揭示了该特征与肿瘤微环境密切相关，特别是保护因子CST3可能通过调节单核细胞功能发挥抗肿瘤作用。最终，整合风险评分和年龄构建的列线图，在预测AML患者总生存期方面表现出高精度和良好的临床适用性。

这项研究不仅为理解ERS在AML中的分子机制提供了新的视角，更重要的是，它开发了一个基于多组学数据的、可量化的预后预测工具。该模型能够为临床医生提供额外的预后信息，有助于实现更精准的患者分层和个体化治疗决策。尽管该模型在多个队列中验证有效，但其因果机制仍需通过体外实验进一步验证。未来，通过调控ERS通路或关键基因，有望为AML的治疗提供新的靶点。