基于CD8+T细胞耗竭相关LncRNA特征的肝细胞癌分子分型及免疫治疗新策略

《Hormones & Cancer》：CD8 T cell exhaustion-associated LncRNA signature reveals novel molecular subtypes and immune targets in hepatocellular carcinoma

本研究针对肝细胞癌（HCC）免疫微环境中CD8+T细胞耗竭（CD8Tex）机制不清的问题，通过单细胞测序分析GSE140228数据集鉴定CD8Tex关键基因，结合TCGA-LIHC队列构建包含5个LncRNA的预后模型。发现AL158166.1与CD8Tex及不良预后显著相关，并建立新型分子分型系统，为HCC免疫治疗精准分层提供理论依据。

　　

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，其中约80%的病例为肝细胞癌。尽管免疫疗法在淋巴瘤和黑色素瘤等癌症治疗中取得了显著进展，但在HCC治疗中，免疫检查点抑制剂（ICB）相比传统酪氨酸激酶抑制剂表现出更优的疗效。然而，其有效性受到多种因素的限制，其中肿瘤浸润淋巴细胞特别是CD8⁺T细胞的耗竭是一个核心问题。

T细胞在介导对肿瘤细胞的保护中起着关键作用，但在癌症中经常出现功能失调和耗竭。T细胞耗竭（Tex）是一个集体术语，涵盖了抗原特异性CD8⁺T淋巴细胞中观察到的所有功能损伤，最初是在慢性病毒感染背景下描述的，这些细胞持续存在但无法清除病原体威胁。研究表明，阻断CD8⁺Tex上表达的共抑制受体如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1），可以重新激活细胞介导的细胞溶解免疫反应以消除持续性病毒感染。随后在癌症中也观察到CD8⁺Tex对肿瘤免疫治疗的反应 similarly diminished。有人认为，通过免疫检查点阻断（ICB）可以单向逆转表达PD-1的细胞从无反应耗竭状态中拯救出来。在癌症中，这被认为涉及功能受损的CD8⁺Tex，它们高表达PD-1，主要位于肿瘤微环境（TME）中。鉴于肝脏不仅是体内重要的免疫器官，也是最大的代谢器官，识别驱动CD8⁺T细胞在HCC中浸润的关键因素并探索其潜在机制是紧迫的科学优先事项。

生物标志物在评估HCC肿瘤进展和预后方面日益突出。其中，长链非编码RNA（lncRNA）因其多样的调控功能和临床相关性而成为主要关注领域。长链非编码RNA是长度超过200个核苷酸的RNA分子，在各种生物体中普遍存在，传统上认为不编码蛋白质。越来越多的证据表明lncRNA的表达失调与肝细胞癌有关，影响其发生和发展，并在脂质代谢、葡萄糖代谢等方面发挥关键作用。此外，最近的研究表明lncRNA与HCC的免疫微环境和免疫细胞浸润密切相关。然而，lncRNA是否与HCC中的CD8⁺T细胞耗竭事件相关以及它们在其中扮演什么具体角色仍有待阐明。

在这项研究中，研究人员通过利用GSE140228数据集的单细胞数据分析了与CD8⁺Tex相关的关键基因。通过细胞间通讯和免疫细胞功能分析，揭示了CD8⁺Tex的相关免疫功能和通路。利用TCGA-LIHC数据集，通过相关性分析鉴定了CD8⁺Tex相关的lncRNA特征。重要的是，在鉴定出的lncRNA中，AL158166.1与CD8 Tex和不良临床结果的相关性最强。基于这些CD8⁺Tex相关的lncRNA特征构建的预后模型对HCC的预后显示出良好的预测效能。此外，研究人员建立了一个与CD8⁺Tex相关lncRNA相关的新的分子分型系统，并揭示了不同分子亚型HCC患者之间的免疫微环境异质性。这种新的HCC分子分型可以指导HCC患者的临床免疫治疗。该研究为HCC的临床治疗和未来靶向药物的开发提供了可靠的理论基础。

为了开展研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用GSE140228单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据鉴定HCC中的CD8Tex细胞簇及其差异表达基因；使用CellChat算法分析CD8Tex细胞与其他免疫细胞（如CD8T细胞、树突状细胞DC、单核/巨噬细胞）之间的细胞间通讯；基于TCGA-LIHC队列（包含375例HCC样本和50例癌旁组织）的转录组数据，通过Pearson相关性分析（相关系数>0.4且p<0.001）筛选CD8Tex相关lncRNA；采用单变量Cox回归、LASSO回归和多变量Cox回归分析构建包含5个lncRNA（LUCAT1, AC026356.1, NUP50-DT, TBX2-AS1, AL158166.1）的预后风险模型；通过共识聚类（ConsensusClusterPlus）对HCC患者进行分子分型；使用多种算法（如ssGSEA、CIBERSORT、TIMER等）评估肿瘤免疫微环境特征；通过qRT-PCR和细胞功能实验（如集落形成实验）验证关键lncRNA AL158166.1在原发性人CD8⁺T细胞中的表达及其对T细胞耗竭标志物（PD-1, TIM-3, CTLA-4）和肿瘤细胞增殖的影响。

3.1 CD8Tex在HCC中的特征

遵循图1A所示的工作流程，研究人员首先分析了肝细胞癌（HCC）单细胞数据集GSE140228并鉴定了CD8Tex细胞簇（图1B）。在肿瘤微环境中，细胞相互作用不仅调节细胞功能，还影响周围的免疫环境，从而影响肿瘤进展。使用CellChat算法，研究人员发现CD8Tex与CD8T细胞、树突状细胞（DC）和单核细胞/巨噬细胞之间存在强烈的相互作用，而与CD4T细胞和B细胞的相互作用相对较弱（图1C）。随后，分析了参与CD8Tex与其他细胞相互作用的基因对。结果表明，CD8Tex作为受体，受到来自其他细胞的HLA和CLEC2D等家族的调控（图1D）。相反，当CD8Tex作为发送者时，它通过PTPR和ITGB等家族调控其他细胞。这些发现强调了CD8Tex在介导HCC免疫景观中细胞间通讯的重要作用。

接下来，研究人员试图鉴定CD8Tex中富集的基因集以阐明其细胞功能。未发现CD8Tex中上调的基因集，但观察到COAGULATION的显著下调，提示CD8Tex潜在的免疫学作用（图2A, B）。此外，注意到CD8Tex中关键免疫相关通路如HALLMARK-ADIPOGENESIS、HALLMARK-ESTROGEN RESPONSE EARLY和HALLMARK-FATTY ACID METABOLISM的显著抑制（图2C）。鉴于大多数转录因子在HCC中的功能已较为明确，分析了CD8Tex中富集的转录因子以揭示其作用。发现LMNA和H3F3A在CD8Tex中显著富集（图2D）。然而，未在CD8Tex中发现富集的转录因子集，表明其可能通过LMNA和H3F3A等个体转录因子发挥调控作用（图2E,F）。

3.2 CD8Tex相关LncRNA的鉴定及预后模型的建立

为了鉴定CD8Tex中特异性表达的基因，研究人员应用|Fold Change|≥2且FDR<0.05的阈值检测差异表达基因，鉴定出1个上调和21个下调基因（表S1）。随后，利用STRING数据库进行进一步分析，确定了16个核心基因（图3A, B）。从TCGA-LIHC获取数据，使用Pearson相关性分析（相关系数>0.4且p值<0.001），筛选出与这16个核心基因高度相关的184个lncRNA（表S2）。通过差异分析，其中仅有93个lncRNA在HCC中差异表达，包括7个下调和86个上调的lncRNA（图3C-D, 表S3）。将TCGA-LIHC数据按相等比例分为训练集和验证集。经过单变量COX回归分析，确定了17个与HCC预后相关的lncRNA（图3E），并展示了它们在HCC样本中的表达水平（图3F）。通过LASSO回归分析排除模型过拟合（图3G, H），并通过多变量COX回归分析，确定了5个lncRNA及其风险评分权重纳入预后模型（图3I, 表S4）。发现这5个lncRNA的表达模式在训练集、验证集和总集中是一致的（图4A-C），不同生存状态患者的分布也是一致的（图4D-F），风险评分曲线相似（图4G-I）。这表明训练集和验证集之间没有显著的选择偏倚。

随后，尝试验证这5-lncRNA预后模型的预测性能。通过绘制生存曲线，发现在训练集、验证集和总集中，高风险组患者的预后更差（图4J-L）。此外，ROC曲线表明，该5-lncRNA预后模型对HCC患者1年、3年和5年生存率在训练集、验证集和总集中均显示出良好的预测效能（图4M-O）。

3.3 风险评分模型的临床相关性

为了评估5-lncRNA预后模型的临床应用性，进行了单变量（FDR<0.05）和多变量COX回归分析（FDR<0.05）以评估风险评分与其他关键临床因素之间的关联。结果表明，风险评分与HCC患者的不良预后显著相关，并且被确定为唯一的独立预后因素（图5A,B）。此外，ROC曲线分析显示，风险评分相较于传统的临床分期因素（如分级和分期）表现出更优的预测性能（图5C）。然后构建了一个包含风险评分和其他临床因素的列线图，为临床医生评估HCC患者提供工具，该模型显示出高度的准确性（图5D,E）。还检查了风险评分与临床因素之间的相关性，揭示了风险评分与HCC患者高分级之间的强关联（图5F, G）。进一步评估了5-lncRNA预后模型在各种临床亚组中的效能。分析表明，无论年龄、分级或分期如何，风险评分都能有效预测HCC患者的预后，包括男性患者（图5H-K）。尽管在女性患者中观察到高风险评分与不良预后相关的趋势，但未达到统计学显著性（p=0.055）（图5H）。

为了研究CD8Tex相关基因和lncRNA在HCC预后中的潜在调控作用，对不同风险评分组进行了基因富集分析。差异分析在高风险组中鉴定出84个下调和374个上调基因（图6A, B）。KEGG富集分析强调了关键免疫信号通路的富集，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-κB信号通路、IL-17信号通路和HIF-1信号通路，以及代谢通路如癌症中的中央碳代谢、果糖和甘露糖代谢以及半乳糖代谢（图6C）。GO富集分析揭示了免疫反应过程的富集，如CXCR趋化因子受体结合、G蛋白偶联受体结合、细胞因子受体结合以及细胞粘附的正向调控。此外，代谢过程如激素代谢过程、外源性物质代谢过程和丝氨酸型内肽酶复合物也富集（图6D,E）。基因集富集分析（GSEA）显示，高风险组患者富集于诸如KEGG_CELL_ADHESION_MOLECULES_CAMS、KEGG_CELL_CYCLE、KEGG_CYTOKINE_CYTOKINE_RECEPTOR_INTERACTION、KEGG_LEISHMANIA_INFECTION和KEGG_PATHWAYS_IN_CANCER等通路，表明免疫信号和癌症相关通路的激活（图6F）。相反，低风险组患者显示在KEGG_DRUG_METABOLISM_CYTOCHROME_P450、KEGG_FATTY_ACID_METABOLISM、KEGG_GLYCINE_SERINE_AND_THREONINE_METABOLISM、KEGG_PRIMARY_BILE_ACID_BIOSYNTHESIS和KEGG_RETINOL_METABOLISM等通路中富集，表明免疫代谢通路的全面抑制（图6G）。这些发现表明CD8Tex和CD8Tex相关lncRNA可能主要调控HCC中的免疫反应和免疫代谢，有助于理解高风险患者预后不良的原因。

为了确定CD8Tex细胞在HCC中的功能是否与肿瘤进展和预后关键基因的突变相关，进行了进一步分析。观察到高风险评分组患者关键基因如TP53的突变率显著更高（34% vs. 17%）（图6H）。此外，这些患者表现出更高的肿瘤突变负荷（TMB）（图6I），并且TMB随着风险评分的增加而增加（图6J）。尝试通过结合TMB和风险评分来评估HCC患者的预后。发现具有高TMB和高风险评分的患者预后最差。相反，具有低TMB和低风险评分的患者预后最好。仅具有高TMB或高风险评分的患者介于这两者之间（图6K）。这些结果表明，CD8Tex细胞在HCC中的功能可能与体细胞突变相关，并且将TMB与基于CD8Tex相关lncRNA的预后模型相结合可以增强对HCC患者预后的预测。

3.5 不同风险评分组患者的免疫微环境分析

为了进一步确认CD8Tex和CD8Tex相关基因的潜在作用，分析了不同风险评分组的免疫微环境。结果显示，高风险组中aDC、iDC和Treg等免疫细胞的浸润增加，而肥大细胞（Mast_cells）的浸润减少（图7A）。使用CIBERSORT算法进一步对免疫细胞进行亚分类，发现高风险组中CD8⁺T细胞、活化NK细胞和静息肥大细胞的浸润显著减少。相反，M0巨噬细胞和中性粒细胞的浸润显著增加（图7B,C）。关于免疫功能，高风险评分组表现出免疫应激和炎症反应相关功能的激活，如APC共刺激、CCR、检查点、MHC I类分子和副炎症。然而，与吞噬作用和免疫监视相关的功能，如细胞溶解活性和II型干扰素反应（Type_II_IFN_Response）被抑制（图7D）。免疫细胞之间的相关性分析显示，高风险评分与常见淋巴祖细胞、CD4⁺Th2 T细胞、中性粒细胞、M1巨噬细胞、单核细胞和巨噬细胞/单核细胞的细胞分数呈正相关。相反，与CD8⁺初始T细胞、常见髓系祖细胞、内皮细胞和造血干细胞的细胞分数呈负相关（图7E）。免疫检查点抑制剂已成为HCC的常规治疗。检查不同风险评分组中免疫检查点基因的表达时，观察到高风险组中几乎所有免疫检查点基因（除ADORA2A外）的表达均升高，表明这些患者可能从免疫检查点抑制剂中获益（图7F）。药物敏感性分析表明，高风险组患者可能受益于ABT737等靶向药物，而低风险组患者可能受益于索拉非尼（Sorafenib）等药物（图S1）。此外，当将基于CD8Tex相关lncRNA的预后分型与官方TCGA免疫分型进行比较时，结果显示预后分型可以区分免疫亚型。具体而言，高风险评分组中免疫C4（炎症型）患者数量显著增加，而免疫C3（淋巴细胞耗竭型）患者数量减少（图7G）。

3.6 基于CD8Tex相关LncRNA的HCC新分子分型

准确的HCC分子分型有助于个性化精准治疗。利用CD8Tex相关预后模型中的所有五个lncRNA，采用ConsensusClusterPlus将HCC患者分为不同的分子亚型。基于Delta area和CDF曲线，在k=5时观察到最佳聚类稳定性（图8A-B）。展示了不同k值下的样本分布（图8C）。一致性矩阵热图表明在k=5时以蓝色调为主，相对稳定（图8D）。生存分析显示C3组预后最差，而C1、C2和C5组表现出良好的预后结果（组间无显著差异），C4组显示出中等预后（图8E）。桑基图说明了C1和C2组内高风险和低风险患者的不同比例，C3和C4组主要为高风险患者，C5组仅为低风险患者（图8F）。PCA（图8G）和tSNE分析（图8H）表明，基于新亚型分类中不同的分子特征，可以很好地区分HCC患者。免疫微环境分析表明，C3组的基质评分（StromalScore）最低，而各组在免疫评分（ImmuneScore）和ESTIMATE评分（ESTIMATEScore）方面未观察到显著差异（图8I-K）。关于免疫细胞浸润，与其他组相比，C3组显示免疫细胞浸润最少（图8L）。免疫检查点基因的分析表明，C1组可能受益于CD274抑制剂，C2组可能受益于IDO2抑制剂，C3组可能受益于LAIR1抑制剂，C4组可能受益于VTCN1抑制剂，C5组可能受益于NRP1抑制剂（图8M），这为指导使用免疫检查点抑制剂提供了依据。此外，药物敏感性分析为不同分子亚型的HCC提供了潜在的靶向治疗见解：C1组可能受益于Elephantin等药物，C2组可能受益于ERK_6604，C3组可能受益于XAV939，C4组可能受益于VX-11，C5组可能受益于MG-132（图S2），这支持了临床个性化治疗策略。

3.7 HCC中CD8⁺Tex相关LncRNA AL158166.1的功能验证

为了验证CD8⁺Tex相关lncRNA在HCC中的表达模式，从解离的人HCC组织中分离CD8⁺T细胞并进行qRT-PCR分析。在从转录组分析中鉴定出的五个候选lncRNA——LUCAT1、AC026356.1、NUP50-DT、TBX2-AS1和AL158166.1中，与总肿瘤组织相比，所有lncRNA在CD8⁺T细胞中均显著上调，其中AL158166.1表现出最高的相对表达量（约增加25倍）（图9A）。鉴于其 predominant expression，选择AL158166.1进行功能表征。建立了AL158166.1过表达和敲低的CD8 T细胞，并通过qRT-PCR确认（图9B）。在使用CD8⁺T细胞和HCC细胞共培养的集落形成实验中，AL158166