机械酶法高效分离原代人牙龈上皮细胞：构建高重复性口腔黏膜体外模型的新策略

本研究针对传统永生化细胞系（如HaCaT或TR146）在口腔黏膜研究中存在的生理相关性不足问题，开发了一种无需饲养层的机械酶法分离技术，成功从健康牙龈组织中获取高纯度原代上皮细胞。该细胞表现出典型铺路石形态、稳定增殖能力和上皮标志物（CK18/AE1-AE3/MUC1）高表达，且无间充质标志物vimentin污染。转录组分析证实其非腺体表型特征（MUC1+/MUC5AC-），WST-1代谢检测与细胞计数高度吻合（r=0.994）。该模型为口腔屏障功能、宿主-微生物互作等研究提供了更可靠的体外平台。

　　

在口腔黏膜研究领域，科学家们长期面临一个关键挑战：如何获得既保持生理特性又具备实验可重复性的细胞模型。传统永生化细胞系（如HaCaT或TR146）虽易于扩增，但存在分化谱系改变和遗传漂变等问题，极大限制了其在屏障功能、伤口愈合和宿主-微生物相互作用等研究的可靠性。特别是在牙龈上皮研究中，这些细胞与口腔生物膜的持续相互作用及其在调节炎症和促进伤口愈合中的关键作用，要求模型必须具有高度生理相关性。

为突破这一局限，来自哥伦比亚的研究团队在《Histochemistry and Cell Biology》发表了创新性研究成果，开发出一种机械酶法联合分离技术，成功从健康牙龈组织中分离出高纯度原代上皮细胞，为口腔黏膜研究提供了更可靠的体外模型。

研究人员采用了几项关键技术：从3名18-30岁健康捐赠者的牙龈切除术样本中获取组织，通过胶原酶I和分散酶II的协同消化结合机械破碎法分离细胞，使用无饲养层培养体系进行扩增。通过免疫荧光/免疫组化检测上皮标志物（CK18、AE1/AE3、MUC1）和间充质标志物（vimentin），采用RT-qPCR分析基因表达谱，并利用WST-1法和直接细胞计数评估增殖动力学。

早期形态学特征和扩增动力学

分离后的细胞显示92%以上高存活率，每克组织获得(1.02±0.18)×10⁶个活细胞。24小时内细胞呈现离散焦点接触和铺展，48小时后形成典型铺路石形态，具有中央核和高核质比。5天后达到90%汇合度，保持上皮极性且无成纤维细胞污染。H&E染色证实细胞间连接完整，与293T/17对照组的间充质形态形成鲜明对比。

增殖动力学和代谢活性

细胞呈现双相生长模式：最初24小时为滞后期，48-96小时进入指数生长期，平均倍增时间41.6±3.8小时。WST-1检测显示代谢活性持续增加，从0小时的0.21±0.004上升到120小时的1.95±0.010。代谢活性与细胞数量高度相关（r=0.994），证明WST-1法可作为增殖监测的可靠替代指标。

表型和转录组验证

免疫荧光显示96.4±2.2%细胞表达CK18，呈现特征性核周丝状分布。免疫组化证实AE1/AE3（97.2±1.1%）和MUC1（78.6±3.2%）阳性，后者显示顶端和核上定位模式。vimentin完全阴性，排除间充质污染。转录分析显示MUC1稳定表达而MUC5AC始终低于检测限，证实非腺体表型。

研究结论强调，这种机械酶法分离的原代牙龈上皮细胞保持了天然上皮特征和免疫应答能力，相比永生化细胞系具有显著生理优势。该模型为研究上皮屏障功能、微生物侵袭和免疫信号提供了可靠平台，特别适用于牙周再生医学和黏膜免疫学领域。虽然研究展示了室内捐赠者间的一致性，但作者指出需要多中心验证来证实其跨年龄、操作者和中心的普遍可重复性。这一技术进展将推动个性化医学在口腔领域的发展，为测试生物活性材料和研究疾病机制提供更准确的体外系统。