遗传密码扩展技术实现枯草芽孢杆菌 surfactin 生物合成的精准时序控制与高效放大生产

《BIOspektrum》：Die Erweiterung des genetischen Codes als molekulare Prozesskontrolle

本研究针对传统诱导表达系统在工业微生物高产过程中存在的启动子干扰与生理负担等问题，创新性地将遗传密码扩展（GCE）技术应用于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中非核糖体肽类表面活性素（surfactin）的生物合成调控。通过引入正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，研究人员成功构建了依赖于非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸（OMeY）的翻译后诱导系统，并在高细胞密度补料分批发酵中实现2.25倍产量提升，为复杂天然产物的精准生物制造提供了新范式。

　　

在生物技术领域，实现微生物细胞工厂的高效生产始终面临着一个关键挑战：如何精确控制目标产物的合成时序。传统方法多采用启动子替换策略，通过外源诱导剂调控基因转录。然而，这种方法往往会对宿主细胞的正常生理功能造成干扰，特别是在工业化高细胞密度发酵过程中，这种干扰可能导致细胞生长受损和产量下降。以具有重要工业应用价值的表面活性素（surfactin）为例，这种由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的生物表面活性剂，其合成由srfA操纵子编码的非核糖体肽合成酶（NRPS）所催化。先前研究表明，即使使用强组成型启动子替换srfA的天然启动子，也未必能有效提高surfactin产量，提示可能存在更复杂的调控机制。

为了解决这一难题，来自霍恩海姆大学的研究团队独辟蹊径，将目光投向了遗传密码扩展（Genetic Code Expansion, GCE）技术。这项技术的核心在于将非天然氨基酸（non-canonical amino acid）精准插入到目标蛋白的特定位点，从而实现对蛋白质功能的精密调控。研究人员设想，能否利用GCE技术，绕过转录水平的复杂调控，直接在翻译后水平控制surfactin合成酶的表达，从而实现对产物合成时序的精准控制？

为了验证这一设想，研究团队开展了一项创新性研究，相关成果发表在《BIOspektrum》期刊上。他们首先在枯草芽孢杆菌surfactin生产菌株中染色体整合了来自詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）的正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/tRNA对，这一系统能够特异性识别通常作为终止密码子的UAG（琥珀密码子），并将其重新编码，用于插入非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸（OMeY）。随后，研究人员对srfAA基因（负责surfactin合成的关键基因）进行了精确的密码子替换，引入UAG琥珀密码子。这一巧妙的设计使得完整功能的非核糖体肽合成酶（NRPS）的表达完全依赖于外源添加的OMeY：只有当OMeY存在时，核糖体才能通读UAG密码子，完成全长合成酶的翻译，进而启动surfactin的生物合成。

研究采用的关键技术方法主要包括：遗传密码扩展（GCE）系统的构建，涉及正交aaRS/tRNA配对在宿主染色体上的整合；目标基因（srfAA）的密码子替换（将特定密码子改为UAG琥珀终止密码子）；使用非天然氨基酸OMeY作为诱导剂；以及在BMV9枯草芽孢杆菌高细胞密度菌株中进行的补料分批生物反应器发酵工艺优化，特别是开发了与补料耦合的OMeY添加策略。

Genetische Code-Erweiterung als Induktionssystem

研究证实，GCE系统成功实现了对surfactin生物合成的翻译后精密控制。通过将正交aaRS/tRNA系统整合至生产菌株染色体，并在srfAA基因中引入UAG密码子，使非核糖体肽合成酶（NRPS）的表达严格依赖于外源OMeY的添加。该策略有效规避了传统启动子替换可能引发的上游基因间区域对srfA表达的干扰，建立了不依赖天然启动子调控的诱导表达系统。

Anwendung im Fed-Batch-Bioreaktorsystem

在摇瓶水平验证OMeY依赖性诱导成功后，研究成功将工艺放大至生物反应器规模。使用高产菌株B. subtilis BMV9（既往发酵产量可达36 g/L）进行高细胞密度补料分批发酵。初始实验在补料阶段一次性添加0.75 mM OMeY，成功诱导了surfactin的胞外积累（诱导前无法检测到surfactin）。但发现随着发酵进行和细胞密度增加，一次性添加会导致诱导剂稀释，浓度不足。

优化策略采用与补料耦合的OMeY添加方式，将诱导剂加入补料液中，维持诱导剂与生物量的恒定比例。此策略使最大surfactin效价提高2.25倍，产物-生物量产量（Y_P/X）和比生产率（q_P/X）均提高约5倍。

为评估GCE对菌株生理的潜在影响，通过质谱分析检测蛋白质组。结果显示菌株出现了生理适应性变化，如前体分子产量增加和鞭毛相关运动性降低，但未观察到细胞生长受损或全局应激反应。

Zusammenfassung und Ausblick

研究表明，GCE作为翻译后水平的分子过程控制策略是可行的，且对微生物生理无显著负面影响。该系统实现了启动子非依赖性的蛋白质表达诱导，并能根据非天然氨基酸诱导剂的添加量精确控制目标生物产品（如surfactin）的产量。这对于像surfactin这样可能对生产菌株产生反馈抑制的产物尤为重要。

未来改进方向包括提高aaRS/tRNA对UAG密码子的识别效率（与细胞内源释放因子竞争）以提升非天然氨基酸的掺入效率。

该研究的重要意义在于首次将GCE技术成功应用于枯草芽孢杆菌的高细胞密度发酵过程控制，建立了一种新型的、精准的微生物合成调控范式。这种翻译后水平的诱导策略为解决工业生物技术中产物合成与细胞生长的矛盾提供了新思路，特别适用于对宿主有潜在毒性的高附加值天然产物的高效生产。