微生物高效合成功能性αS1-酪蛋白突破：磷酸化模拟策略解锁无动物源乳蛋白应用前景

《BIOspektrum》：Tierfreie Milchproteine: Funktionales αS1-Casein erstmals in E. coli produziert

为突破重组酪蛋白生产中翻译后修饰瓶颈，Balasubramanian等开展微生物合成功能性αS1-酪蛋白研究。通过共表达细菌激酶实现高效磷酸化，或采用天冬氨酸替代策略模拟磷酸化，成功获得具备钙结合能力的功能性蛋白，为可持续乳蛋白生产提供新方案。

　　

随着全球对可持续食品需求的快速增长，传统畜牧业面临严峻的环境挑战。牛乳作为重要营养来源，其生产过程中产生的温室气体排放和资源消耗引发广泛关注。在此背景下，无动物源乳蛋白的开发成为食品科技领域的前沿热点。其中，酪蛋白作为乳蛋白的主要成分，其功能性高度依赖于翻译后修饰（post-translational modifications），特别是丝氨酸残基的磷酸化修饰，这对蛋白质的钙结合能力和胶束形成至关重要。

然而，在微生物系统中实现酪蛋白的正确磷酸化一直是个重大技术瓶颈。常规的重组表达系统难以模拟哺乳动物细胞复杂的修饰机制，导致产生的酪蛋白缺乏功能性。正是针对这一挑战，Balasubramanian团队在《Trends in Biotechnology》上发表了创新性研究成果，并被《BIOspektrum》期刊重点推荐。

本研究主要采用激酶共表达系统和基因定点突变技术。通过将枯草芽孢杆菌激酶PrkD/YabT与α_S1-酪蛋白在大肠杆菌中共同表达，实现特异性磷酸化；同时设计天冬氨酸替代突变体模拟磷酸化状态。功能验证通过质谱分析磷酸化位点，二维凝胶电泳评估蛋白特性，动态光散射测定流体力学直径，圆二色谱分析二级结构，并结合钙结合实验和胃液稳定性测试。

激酶共表达实现高效磷酸化

研究人员首先将枯草芽孢杆菌来源的PrkD和YabT激酶与α_S1-酪蛋白在大肠杆菌中共表达。质谱分析显示，PrkD能够磷酸化全部9个天然丝氨酸位点，YabT也可磷酸化其中8个位点。这种细菌激酶系统成功模拟了天然酪蛋白的磷酸化模式，为微生物生产功能性乳蛋白提供了新途径。

磷酸化模拟突变体的设计验证

为规避复杂的磷酸化过程，团队创新性地将8个关键丝氨酸残基替换为带负电荷的天冬氨酸。通过内在荧光发射光谱证实，这种突变有效模拟了磷酸化修饰的静电特性，产生的蛋白表现出与天然磷酸化酪蛋白相似的结构特征。

钙结合功能与结构特性分析

比色法测定显示，两种重组α_S1-酪蛋白均具备钙离子结合能力，其中磷酸化模拟突变体在模拟胃液中表现出更高的稳定性。圆二色谱数据支持酪蛋白低二级结构含量的特性，证实其本质无序蛋白的特征。动态光散射结果表明，磷酸化修饰显著影响蛋白的聚集状态：天然牛α-酪蛋白和未磷酸化重组蛋白流体力学直径约为6纳米，而磷酸化变体直径增大至12纳米。

该研究成功证明了大肠杆菌系统生产功能性α_S1-酪蛋白的可行性。两种策略各具优势：激酶共表达可实现天然样磷酸化，而天冬氨酸替代策略则提供了更稳定、可控的生产方案。这些发现不仅为无动物源乳制品的商业化生产奠定了技术基础，更深化了对酪蛋白结构与功能关系的理解。值得注意的是，磷酸化模拟策略的创新应用为其他需要复杂翻译后修饰的蛋白生产提供了重要借鉴，标志着合成生物学在食品科学领域的应用进入新阶段。随着技术的进一步优化，微生物合成的功能性酪蛋白有望在素食食品、特殊医学用途配方食品和可持续农业等领域发挥重要作用。