化学可裂解探针可视化GPCR共内化：高内涵成像揭示受体互作新机制

《BIOspektrum》：Chemisch spaltbare Sonden zur Visualisierung ko-internalisierter Rezeptoren

本期推荐一项创新性化学生物学研究：为解析GPCR（G蛋白偶联受体）共内化机制，研究人员开发了基于SNAP-/HaloTag的自标记酶系统，结合二硫键可裂解荧光染料（如BG-SS-SulfoCy5），通过高内涵成像定量分析了GLP1R（胰高血糖素样肽-1受体）与GIPR（胃抑制多肽受体）的协同内化行为。研究发现，双受体共表达时GIPR内化增强，但FRET实验未检测到胞内共定位，提示互作可能发生于细胞膜层面。该技术为受体信号偏倚调控与药物开发提供了动态可视化工具。

　　

细胞表面受体如同细胞的“天线”，负责感知外界信号并启动内部应答。其中，G蛋白偶联受体（GPCR）家族作为最大的膜受体群体，调控着从神经传递到代谢平衡的多种生理过程。然而，GPCR功能的复杂性远超出传统认知：不同受体之间存在“对话”（crosstalk），形成动态互作网络，影响信号转导效率与药物反应。例如，在2型糖尿病治疗中，双靶点激动剂Tirzepatid（TZP）可同时激活GLP1R（胰高血糖素样肽-1受体）和GIPR（胃抑制多肽受体），但其协同作用机制尚不明确。究竟是双受体在胞内“结伴而行”，还是仅在膜表面短暂互动？这一科学问题亟待高时空分辨率的可视化技术来解答。

为解决上述挑战，研究团队开发了一套化学可裂解荧光探针系统。其核心技术包括：①利用SNAP-Tag与HaloTag自标记酶对GPCR进行特异性标记；②设计含二硫键的细胞非通透性荧光染料（如SulfoCy3/SulfoCy5），实现细胞膜受体池的精准标记；③通过还原剂MESNA（2-巯基乙磺酸钠）裂解二硫键，选择性清除非内化受体信号；④结合高内涵自动成像与FRET（F?rster共振能量转移）技术，定量分析受体内化动力学与空间共定位。实验采用HEK293细胞模型，共表达Halo-GLP1R与SNAP-GIPR，并利用肽类激动剂（GLP1、GIP）及双靶点激动剂TZP进行刺激。

High-Content-Visualisierung von Halo-GLP1R/SNAP-GIPR-Ko-Internalisierung（Halo-GLP1R/SNAP-GIPR共内化的高内涵可视化）

通过96孔板高通量成像与MESNA信号剥离技术，研究人员发现：在双受体共表达体系中，SNAP-GIPR的内化程度显著高于单受体表达系统，且这一现象在GLP1或GIP刺激后更为明显。而Halo-GLP1R的内化水平不受GIPR共存影响，提示GIPR可能依赖GLP1R实现高效内化。

Ko-Internalisierungsverhalten quantifiziert（共内化行为的量化分析）

为进一步验证双受体是否共同内化至同一胞内区室，团队采用FRET受体光漂白技术。结果显示：尽管SNAP-GIPR内化增强，但SulfoCy3（供体）在SulfoCy5（受体）漂白后的荧光强度未显著变化，表明两种受体在胞内未达到10 nm以内的近距离互作范围。这一结果否定了GLP1R与GIPR在内涵体或溶酶体中形成稳定复合物的假设。

本研究首次将可裂解荧光探针与双色FRET技术结合，实现了GPCR内化路径的动态追踪。关键结论指出：GLP1R与GIPR的互作发生于细胞膜层面，而非胞内区间。这一发现为理解受体偏倚信号（Biased Signaling）提供了新视角——药物设计或需聚焦于膜受体复合物的构象调控，而非仅关注内化后事件。该技术平台可拓展至离子通道、酶联受体等膜蛋白研究，为精准医学开发提供高时空分辨率的分子探针。