冷冻电镜揭示PRD1噬菌体蛋白P12介导的蛋白引发DNA复制新机制

《BIOspektrum》：Kryo-EM enthüllt Mechanismen viraler Replikationsstrategien

本刊推荐：为解决线性DNA末端复制难题，研究人员开展PRD1噬菌体单链DNA结合蛋白P12的结构与功能研究。通过高分辨率冷冻电镜技术解析P12-ssDNA复合物结构，发现其独特的OB折叠变构模式与协同丝状组装机制，为理解病毒复制策略及SSB蛋白进化提供新见解。

　　

在分子生物学的中心法则中，DNA复制是所有生命体延续遗传信息的核心环节。然而线性DNA分子在复制末端时会面临一个根本性难题——末端复制问题。这是由于DNA聚合酶只能沿5'→3'方向合成新链，且需要RNA引物提供3'-OH末端作为起始点。当最后一个RNA引物被移除后，染色体末端会逐渐缩短，如同每次细胞分裂都会磨损的"分子钟摆"。真核生物通过端粒酶来解决这一难题，但自然界还演化出了另一种巧妙的策略：蛋白引发的DNA复制。

这种特殊复制机制常见于腺病毒、某些细菌噬菌体和质粒中，其核心在于用一个蛋白质分子替代RNA引物，直接提供启动DNA合成所需的羟基。在PRD1噬菌体这一模式系统中，这一过程由三个关键蛋白协同完成：末端蛋白P8作为共价连接的分子引物，DNA聚合酶P1负责链的合成与校正，而单链DNA结合蛋白P12则保护暂时暴露的单链DNA区域，防止其降解或形成二级结构。

尽管P12蛋白早在1990年就被发现参与PRD1的DNA复制，但其精确的分子机制一直未被阐明。直到苏黎世联邦理工学院Biosystems科学与工程系的Lena Klara Tr?ger和Nicolas Huguenin-Dezot研究团队利用冷冻电子显微镜技术，成功解析了P12与ssDNA复合物的高分辨率结构，才揭开了这一关键蛋白的独特工作机制。

研究人员主要运用冷冻电镜技术，通过优化ssDNA底物类型逐步提升分辨率。首先使用非重复序列ssDNA获得3.71 ?初步结构，随后采用5核苷酸重复序列将分辨率提升至3.1 ?，最终使用poly(dT)均聚物底物获得全局分辨率达2.75 ?的原子级结构。利用螺旋对称性处理和先进的图像处理算法，成功重构了P12-ssDNA复合物的三维结构。

结构特征揭示独特结合机制

研究发现P12蛋白沿ssDNA链形成连续丝状结构，两个反平行排列的ssDNA链以6-7 ?间距并行排列，但核苷酸间无直接相互作用。每个P12原体结合6个核苷酸，其N端结构域呈现五条反平行β链和一条α螺旋的拓扑结构，与经典OB折叠 motif相似但存在显著差异。

非典型OB折叠实现特异性识别

与典型OB折叠形成封闭β桶状结构不同，P12的β链形成开放的"镊子状"结构，产生具有正电表面电势的特异性ssDNA结合口袋。这种结构变异解释了P12为何能进化出独特的ssDNA结合特性，同时保留通过磷酸骨架相互作用实现序列非依赖性结合的核心功能。

C端α螺旋介导协同组装

实验观察到的正协同性源于C端α螺旋与相邻亚基的相互作用，通过疏水作用和静电接触实现原体间的稳定交联。这一结构锚定机制确保了沿ssDNA的协调排列，对于复制中间体的稳定性至关重要。

该研究不仅首次揭示了PRD1噬菌体P12蛋白的原子级结构，更重要的是阐明了其通过非典型OB折叠实现ssDNA识别和通过C端螺旋介导协同组装的独特机制。这种结构设计完美适配蛋白引发复制策略的特殊需求：开放构象允许原体间协同作用，同时保持序列非依赖性结合的核心功能。研究还展示了冷冻电镜在分析小蛋白结构方面的强大潜力，特别是当利用内在对称性优化信噪比时。

这些发现对理解病毒复制机制具有深远意义。P12代表了一类进化独特的SSB蛋白，其结构特征为开发针对病毒复制过程的干预策略提供了新靶点。更广泛地说，对SSB蛋白的深入研究有助于阐明DNA复制、重组和修复等核心细胞过程的基本机制，为生物技术应用和抗病毒药物设计提供理论基础。这项发表于《BIOspektrum》的研究通过结构生物学方法解决了一个长期存在的分子机制问题，为相关领域的研究树立了新标杆。