豌豆根腐病现场快速诊断技术：基于LAMP的便携式检测系统开发与应用

《Scientific Reports》：Loop mediated isothermal amplification (LAMP) as a rapid and portable diagnostic tool for the detection of pea root rot pathogens

本研究针对豌豆根腐病病原（Aphanomyces euteiches、Fusarium spp.、Pythium ultimum）传统检测方法成本高、耗时长、依赖实验室的痛点，开发了一种基于环介导等温扩增（LAMP）的便携式检测技术。通过靶向病原菌ITS1区域设计特异性引物，实现在60分钟内对土壤和染病根系中低至0.02 ng gDNA或10个孢子/样本的高灵敏度检测。该技术通过便携设备PEBBLE与磁珠法快速提取gDNA结合，验证了其田间应用的可行性，为农民提供成本低于10英镑/样本的现场诊断方案，对早期病害干预和作物损失控制具有重要意义。

　　

豌豆作为可持续农业的关键作物，因其固氮能力和高植物蛋白含量备受青睐，全球豌豆蛋白市场年复合增长率预计达13%。然而，由土传病原菌（如Aphanomyces euteiches、Fusarium solani、Pythium ultimum等）引起的根腐病严重制约其生产，导致植株发黄、矮化甚至绝收。这些病原菌可协同侵染，形成厚垣孢子在土壤中存活数十年，而现有检测方法（如土壤诱饵法、qPCR）需耗时2–6周且依赖专业实验室，难以支持田间即时决策。

为解决这一难题，约翰英纳斯中心的研究团队在《Scientific Reports》发表研究，开发了一种基于环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）的便携式检测工具。该技术靶向病原菌核糖体内部转录间隔区1（Internal Transcribed Spacer 1, ITS1），通过设计特异性引物，在恒温条件下快速扩增病原DNA，实现60分钟内完成检测。研究通过对比颜色法（颜色由粉变黄）和荧光法（RealAmp）验证其可靠性，并整合磁珠法快速提取gDNA与便携设备PEBBLE，构建了成本低于10英镑/样本的田间检测流程。

关键技术方法

研究首先从感染豌豆根腐病的田间样本中分离病原菌（包括A. euteiches、F. solani等），通过ITS1序列比对设计LAMP引物。采用颜色法与荧光法优化反应条件（66°C, 35–60分钟），并利用qPCR平行验证灵敏度。田间样本通过土壤诱饵法获取，gDNA提取分别采用柱式法（高纯度）和磁珠法（快速田间适用），最后通过PEBBLE设备实现实时颜色指数分析。

结果与分析

1. 引物设计与反应优化

基于ITS1区域设计的引物对四种病原菌（A. euteiches、P. ultimum、F. solani、F. oxysporum）均显示高特异性。系统发育树分析表明ITS1能有效区分目标病原与近缘种。优化后反应条件为66°C下35分钟（P. ultimum需41分钟），且引物在NCBI数据库中覆盖率达100%。

2. 检测特异性与灵敏度

引物对20种真菌/卵菌测试中仅F. solani引物与F. redolens（SA119）出现微弱交叉反应。灵敏度测试显示，颜色法最低检测限为0.2 pg（F. solani），荧光法为0.02 ng（所有病原）。在高gDNA浓度（≥10 ng）下，20分钟内即可检出信号。

3. 植株与土壤检测验证

在无菌蛭石、灭菌土壤和标准土壤中接种病原孢子（10–10⁵个/样本），LAMP在根和土壤样本中均能检测低至10个孢子的初始接种量。标准土壤因微生物群干扰，灵敏度下降10–100倍，但协同接种（A. euteiches + F. solani）可提升检测效率。qPCR对比显示LAMP灵敏度相当或更优，且无脱靶扩增。

4. 便携设备田间验证

使用PEBBLE设备结合磁珠法gDNA提取，对田间样本（含典型蜂蜜色根腐症状）进行检测，成功检出A. euteiches阳性样本（JCM 2 R、JCM 3 R），而健康对照无信号。该流程将检测成本降至3.83英镑/样本，耗时60分钟。

结论与意义

本研究开发的LAMP检测技术突破了传统方法对实验室的依赖，通过靶向ITS1区域实现了豌豆根腐病病原的快速、低成本田间诊断。其高灵敏度（0.02 ng gDNA）和便携性（PEBBLE设备）使其成为农民和农艺师实施早期病害管理的实用工具。未来通过扩展病原检测范围（如F. avenaceum等）和优化基因组数据库，可进一步提升该技术在复杂土壤环境中的准确性，为全球豆科作物可持续生产提供关键技术支撑。