猪胚胎中长链非编码RNA与TET家族基因的转录组学关联及其在原始生殖细胞特化中的表观遗传调控作用

《Scientific Reports》：Transcriptomic analysis of long non coding RNAs and their association with TET family genes in Sus scrofa embryo

本研究针对猪早期胚胎发育过程中长链非编码RNA（lncRNA）的功能及其与TET家族基因（TET1/2/3）的相互作用机制展开系统性分析。通过单细胞转录组测序技术，研究人员鉴定了逾15万条lncRNA转录本，揭示了其在原始生殖细胞（PGC）特化阶段的动态表达谱，并预测了lncRNA与TET基因的调控网络。该研究首次阐明了lncRNA通过协同TET介导的DNA去甲基化（5mC→5hmC）参与猪PGC表观重编程的潜在路径，为哺乳动物生殖细胞发育的表观遗传调控提供了新视角。

　　

在哺乳动物胚胎发育的早期阶段，细胞命运决定伴随着复杂的表观遗传重编程过程，其中DNA甲基化与去甲基化的动态平衡对原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）的特化至关重要。Ten-eleven translocation（TET）家族基因（TET1、TET2、TET3）作为DNA主动去甲基化的关键酶，能够催化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC），但其在猪PGC特化过程中的调控机制尚不明确。同时，长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）作为表观遗传调控的重要参与者，在多种生物过程中展现出发育阶段特异性和细胞类型特异性的表达模式，但其与TET家族基因的协同作用在猪胚胎中的研究仍属空白。

为解决上述问题，Itishree Jali与Shailesh Sharma团队在《Scientific Reports》上发表了题为“Transcriptomic analysis of long non coding RNAs and their association with TET family genes in Sus scrofa embryo”的研究。该研究利用公共数据库（GEO accession: GSE155136）中猪早期胚胎的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，涵盖了E11外胚层细胞、E14体细胞、E14 PGCs和E31 PGCs四种细胞类型，通过生物信息学分析系统鉴定了lncRNA的表达谱，并深入探讨其与TET家族基因的调控关联。

研究采用的关键技术包括：基于FastQC与Trimmomatic的原始测序数据质控与过滤、使用HISAT2进行基因组比对（参考基因组Sscrofa11.1）、通过StringTie进行转录本组装与定量（FPKM标准化）、利用CPC2与Pfam数据库筛选非编码转录本、通过edgeR和NOISeq进行差异表达分析、基于WGCNA构建共表达网络、借助LncTar预测RNA-RNA相互作用，并结合MISA工具分析微卫星重复序列的分布特征。

lncRNA在猪胚胎细胞中的特征与分布

研究共鉴定出37,502（E11外胚层）、46,208（E14体细胞）、32,216（E14 PGCs）和36,014（E31 PGCs）条lncRNA转录本，按其基因组位置分为内含子型（intronic, “i”）、基因间型（intergenic, “u”）和反义型（antisense, “x”）三类。其中E14体细胞的lncRNA数量最多，而E14 PGCs中数量显著减少，提示PGCs在表观重编程过程中可能伴随转录沉默。基因组坐标分析显示，反义lncRNA的转录本长度普遍长于其他两类，可能与其跨染色质区域调控功能相关。

lncRNA的染色体水平分布

染色体定位分析表明，lncRNA在18条常染色体和性染色体上分布不均，其中E14体细胞的lncRNA密度最高，而E14 PGCs中密度降低，进一步支持了PGCs在迁移前经历转录抑制的假设。线粒体基因组中也检测到基因间型lncRNA，暗示其可能参与能量代谢相关调控。

差异表达基因与TET家族基因的动态变化

差异表达分析发现，TET1在PGCs特化过程中表达显著下调（如E14体细胞 vs E31 PGCs中log₂FC=-13.84），而TET3在体细胞中特异性高表达。TET2在PGCs与体细胞中均检测到表达，但其变化幅度较小。这些结果与小鼠中的报道一致，表明TET家族基因在猪PGCs表观重编程中具有功能保守性。

差异表达lncRNA与TET基因的共表达网络

通过WGCNA分析，研究筛选出116条与TET家族基因共表达的DE-lncRNAs，其中56条与TET1或TET3存在潜在相互作用。LncTar预测显示，内含子型lncRNA TCONS_00151670与TET1位于同一染色体（chr14），可能通过顺式调控影响TET1表达。其余互作lncRNA多为反义型，可能通过招募染色质修饰复合物行使转录抑制功能。

微卫星重复序列的功能暗示

MISA分析显示，DE-lncRNAs与差异表达基因（DEGs）中富含多聚A/T单核苷酸重复及AC/GT二核苷酸重复序列，这些微卫星可能通过影响RNA二级结构或蛋白质结合参与转录调控，但其在胚胎发育中的具体功能需进一步验证。

基因功能富集分析揭示发育调控路径

GO富集分析表明，E11外胚层向E31 PGCs转化过程中，细胞定位（GO:0051179）与运输（GO:0006810）相关通路显著激活，而E14 PGCs中氧化应激响应与细胞黏附相关基因上调，提示PGCs在迁移前需适应微环境变化。E31 PGCs中核内腔（GO:0031981）与RNA结合功能增强，预示其向生殖系定向分化的启动。

本研究通过整合多组学数据，首次系统性描绘了猪胚胎发育过程中lncRNA与TET家族基因的调控图谱，不仅揭示了lncRNA在PGCs表观重编程中的潜在作用，还为理解哺乳动物生殖细胞发育的进化保守性提供了重要依据。尽管LncTar预测的RNA互作仍需实验验证（如RNA pull-down或CLIP-seq），但该研究为后续探索lncRNA-TET轴在农业育种和人类生殖疾病中的应用奠定了理论基础。