RIG-I基因在鸡中的遗传重建揭示禽类免疫进化与流感互作的新见解

本研究通过遗传学方法在鸡中重建了鸭源RIG-I和RNF135基因，揭示了RIG-I缺失在禽类进化中的适应性意义。实验表明RIG-I的表达会引发过度炎症反应（如IL-6、IFN-γ上调），导致H7N1/H3N1流感病毒感染后病情恶化（体重下降、病毒复制增加），而RNF135的共表达可平衡免疫反应。研究证实RIG-I的进化缺失是禽类应对病毒感染的适应性策略，为禽类免疫进化提供了重要理论依据。

　　

引言

禽流感病毒(AIV)是一种具有人畜共患潜能的动物流行病病原体，其在野生水禽（雁形目和鸻形目）中形成天然储存库。与鸡等 Galliformes 鸟类相比，鸭类对临床禽流感感染表现出相对抵抗力，这种差异可能与鸭类拥有功能性视黄酸诱导基因I（RIG-I）有关。RIG-I作为一种胞质RNA传感器，通过识别5’三磷酸末端（5’-ppp）激活线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），启动I型和III型干扰素（IFNs）上调及干扰素刺激基因（ISGs）表达的抗病毒反应。其活性受三联基序蛋白25（TRIM25）和环指蛋白135（RNF135/Riplet）的泛素化调控。

值得注意的是，家鸡缺乏RIG-I和RNF135基因，这种缺失被认为与其对禽流感的易感性增加相关。先前研究表明鸭RIG-I在鸡DF-1细胞中的过表达可限制高致病性禽流感病毒（HPAIV）复制，但RIG-I在鸡体内表达的功能后果尚未明确。本研究利用原始生殖细胞（PGCs）技术，首次成功构建了表达鸭源RIG-I和RNF135的转基因鸡模型，旨在探究这两个基因在禽类免疫系统中的作用及其对流感病毒感染的反应机制。

结果

成功构建表达鸭RIG-I与RNF135的转基因鸡模型

研究团队通过PGCs基因编辑技术，将鸭源RIG-I和RNF135基因分别置于其自身启动子调控下，成功获得转基因鸡系。启动子活性检测显示，鸭RNF135启动子在鸡DF-1细胞中具有功能性活性。通过FLAG标签标记证实，RIG-I在PGC来源的成纤维细胞（PGCFs）中经H9N2低致病性禽流感病毒（LPAIV）感染后可被有效激活。

令人意外的是，与先前细胞水平研究结果相反，在鸡胚成纤维细胞（CEFs）和鸡胚中，RIG-I的表达并未显著抑制H9N2病毒的复制。这一差异提示启动子选择可能影响RIG-I的表达水平和抗病毒效果。

转基因鸡的免疫表型特征

在未感染状态下，RIG-I表达鸡表现出显著的适应性免疫细胞变化：αβ和γδ T细胞以及B细胞数量显著增加，而单核细胞数量无变化。进一步分析显示CD4⁺T细胞和CD8α^negT细胞数量升高，CD8α^+highT细胞数量降低。ConA刺激后，TCR1⁺/CD25⁺T细胞激活水平增强。

值得注意的是，RIG-I与RNF135共表达鸡的免疫表型与野生型（WT）鸡相似，表明RNF135可能平衡RIG-I引起的免疫细胞变化。两种转基因鸡系生长发育正常，未出现有害表型，且基因表达组织分布与鸭类相似。

H7N1感染揭示RNF135对RIG-I功能的调控作用

用H7N1禽流感病毒（HPAIV前体）挑战实验显示：

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  RIG-I表达鸡发病率最高（2 dpi达67%），出现严重体重下降和肺部病变（评分2.3）
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  RIG-I-RNF135共表达鸡呈现持续性临床症状，死亡率持续至6 dpi
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  RNF135单独表达鸡的死亡率与WT鸡相似

病毒复制分析显示，RIG-I表达鸡在肺和盲肠中病毒基因组拷贝数最高，而RIG-I-RNF135共表达鸡病毒载量显著降低。这表明RNF135作为泛素连接酶，在感染早期增强RIG-I抗病毒活性中起关键作用，且鸡TRIM25不能替代RNF135功能。

感染诱导RIG-I表达显著上调（盲肠中约26倍），RNF135在肺中表达上调约6倍，表明感染急性期快速激活了这两个基因。

先天免疫基因的差异调控

Fluidigm qRT-PCR阵列分析显示，在未感染状态下，RIG-I-RNF135共表达鸡盲肠中ISG12-2、OASL和早期生长反应蛋白1（EGR1）等基因表达已显著上调。感染后，RIG-I表达鸡独特上调多个炎症基因（如IFITM1、IL6、LIPI），并持续至感染后期（脾脏中20多个基因特异性上调）。

功能富集分析表明，RIG-I表达鸡调控基因主要参与代谢活动，而RIG-I-RNF135共表达鸡则主要涉及调控机制。RIG-I-RNF135共表达鸡特异性表达IRF7和TRIM25，这可能是其免疫表型差异的重要原因。

IFN-γ高表达与病毒复制增加相关

RIG-I表达鸡在感染后缺乏干扰素上调，但IFN-γ表达在6 dpi时显著增加（较RIG-I-RNF135鸡高14倍，较WT鸡高9倍）。相反，RIG-I-RNF135共表达鸡在2 dpi即表现出IFN-α显著上调。这表明RNF135共表达促进早期I型干扰素反应，而单独RIG-I表达导致IFN-γ上调可能与病毒复制增加相关。

病毒毒力决定炎症反应严重程度

用低毒力H9N2病毒攻击时，转基因鸡未出现临床疾病。而用高毒力H3N1病毒攻击时，RIG-I和RIG-I-RNF135表达鸡均出现严重临床表现：早期发病、死亡率增加、炎症基因（IL-1β、IL6、IFN-α、IFN-γ）上调，以及生殖系统严重病变（输卵管萎缩、纤维素性腹膜炎、血管炎）。这表明RIG-I触发的有害炎症反应需要一定程度的病毒毒力。

讨论

本研究首次在体内证实鸡类RIG-I缺失可能是进化中的适应性选择。与预期相反，RIG-I重建不仅未提供保护作用，反而导致流感感染后过度炎症反应和病情加重。这种有害表型需要RNF135协同作用，且取决于病毒毒力水平。

研究发现揭示了RIG-I在禽类中的双重作用：一方面调节适应性免疫（T细胞和B细胞）；另一方面在病毒感染时可能引发有害炎症。RNF135的共表达平衡了这种反应，表明鸭类RIG-I的有效抗病毒功能可能需要RNF135和其他未知调控因子的协同作用。

研究结果对禽类免疫进化提供了新见解：RIG-I在Galliformes鸟类中的缺失可能是一种进化策略，用以避免病毒感染引发的过度炎症损伤。同时，该研究为开发抗流感转基因禽类提供了重要参考，提示未来需要寻找既能增强抗病毒能力又不引起有害炎症的调控因子。

材料与方法

研究使用白来亨鸡品系，通过PGCs基因编辑技术构建转基因鸡。鸭RIG-I和RNF135基因克隆自绿头鸭，并置于其自身启动子控制下。通过ddPCR筛选单拷贝整合的PGC克隆，采用phiC31整合酶系统确保转基因稳定整合。

体外实验使用CEFs和PGCFs细胞，感染H9N2和H1N1-WSN病毒株。体内实验包括H7N1、H3N1和H9N2病毒感染挑战，监测临床表现、病毒载量、免疫细胞数量和基因表达变化。采用Fluidigm动态阵列进行多基因表达分析，流式细胞术分析免疫细胞群体，组织学检查评估病变程度。

统计分析采用SPSS软件，根据数据正态性选择T检验、Wilcoxon检验、ANOVA或Kruskal-Wallis检验。显著性水平设定为p<0.05。