新型免疫生物标志物在少关节型幼年特发性关节炎多关节扩展风险早期分层中的应用研究

本综述深入探讨了少关节型幼年特发性关节炎（Oligoarthritis）患者向多关节扩展（polyarticular extension）的早期免疫预测标志物。研究通过分析患者滑膜液（SF）和外周血（PB）中T细胞、单核/巨噬细胞（MM）亚群的组成、活化状态（如HLA-DR+细胞）及细胞外囊泡（EV）表面标志物（如HLA-ABC、CD3），结合可溶性TREM1（sTREM1）水平，揭示了多个具有高区分效能（AUC>0.8）的免疫指标。这些发现为早期识别高风险患者、指导靶向治疗（如DMARDs）提供了重要依据，对改善临床预后具有重要意义。

　　

引言

少关节型幼年特发性关节炎（Oligoarthritis）是西方最常见的一种幼年特发性关节炎（JIA）亚型，也是导致儿童残疾的主要原因之一。其临床病程多变，早期识别那些可能进展为多关节扩展（定义为两年内受累关节数≥4个）的患儿，对于指导靶向治疗至关重要，但这依赖于新的生物标志物的发现。本研究旨在通过分析新发病例滑膜液（SF）和外周血（PB）中T细胞、单核/巨噬细胞（MM）亚群的组成、活化/成熟状态，并结合细胞外囊泡（EV）的表面标志物，前瞻性地评估它们与两年随访期内临床病程的相关性，从而识别潜在的预后生物标志物。

材料与方法

研究招募了42名未经治疗的新发Oligoarthritis患儿（年龄1-16岁），所有患者均符合ILAR分类标准（疾病前6个月内受累关节≤4个）。在诊断时收集配对的SF和PB样本。通过流式细胞术分析免疫细胞亚群，采用基于微球的多重检测分析EV标志物表达谱，并使用ELLA方法检测可溶性TREM1（sTREM1）水平。根据患者两年的随访情况，将其分为两组：Group 1（维持少关节病程）和Group 2（进展为多关节扩展）。统计分析采用GraphPad Prism和MedCalc软件，组间比较使用t检验或Mann-Whitney检验，并通过ROC曲线评估各变量的区分能力。

研究人群特征

两组患者在发病年龄上无显著差异（Group 1平均5.9岁 vs Group 2平均5.5岁），性别比例（Group 2女性稍多）也无统计学意义。然而，Group 2患者在发病时表现出更多的临床特征：62%的Group 1患儿发病时仅单个关节受累，而Group 2中仅有19%；超过80%的Group 2患者有两个及以上关节受累，而Group 1仅为38%。Group 2也更常出现踝关节（38% vs 19%）、小手关节（19% vs 9.5%）受累、对称性分布（47.6% vs 14.2%）和上肢关节炎（28.5% vs 14.2%）。炎症标志物ESR（平均39.5 vs 23.9）和CRP（平均1.2 vs 0.7）水平在Group 2中也更高。在治疗方面，Group 1更多单独使用关节内皮质类固醇注射（IAS）（71.4% vs 47.6%），而Group 2更常联合使用甲氨蝶呤（MTX）（47.6% vs 23.8%）。随访结束时，所有Group 2患者都经历了关节复发，而Group 1仅为57%。

SF中T淋巴细胞和MM亚群的比例及活化状态可区分不同病程的患者

流式细胞分析显示，Group 2患者SF中CD3⁺ T细胞百分比显著更高（68.2% ± 4.4 vs. 58.4% ± 2.3），而CD14⁺ MM百分比显著更低（15.07% ± 2.7 vs 24.19% ± 2.4），导致CD3:CD14比值在Group 2中显著更高（5.3 ± 0.8 vs 2.6 ± 0.2）。ROC分析表明，该比值（cut-off 3.97）能很好地区分两组（AUC = 0.831, p<0.005）。在T细胞亚群中，Group 2患者的CD4⁺细胞比例显著更低（28.73% ± 2.4 vs 35.85% ± 2.3），而CD8⁺细胞比例有更高趋势。更重要的是，Group 2患者CD4⁺细胞中HLA-DR⁺（活化）细胞的比例显著更高（64.8% ± 3.6 vs. 52.5% ± 3.4）。两组间的调节性T细胞（Treg）频率则无差异。对T细胞成熟状态的分析（na?ve, CM, EM, EMRA）在SF中未发现组间显著差异。进一步的viSNE和FlowSOM分析证实了Group 2中CD4⁺细胞HLA-DR表达更高，并在CD8⁺ EM细胞中发现了一个Group 1中未见的独特HLA-DR^high细胞簇。

PB中T细胞活化状态和成熟亚群比例在疾病早期具有判别价值

与SF不同，PB中的CD3:CD14比值在两组间无差异。但Group 2患者同样显示出更低的CD4⁺细胞比例（50.87% ± 2.0 vs. 59.01% ± 2.9）和更高的CD8⁺细胞趋势。关键的发现是，Group 2患者PB中HLA-DR⁺ CD4⁺（7.7% ± 0.9 vs 3.4% ± 0.4）和HLA-DR⁺ CD8⁺（15.6% ± 3.6 vs 5.6% ± 0.6）细胞比例均显著升高，其判别效能极高（AUC均为0.946, p<0.001）。在成熟亚群分析中，Group 1患者na?ve CD4⁺（75.4% ± 3.3 vs 57.8% ± 2.8）和na?ve CD8⁺（68.9% ± 3.7 vs 48.5% ± 4.7）细胞比例显著更高，而Group 2患者的EM CD4⁺（22.2% ± 1.3 vs 12.1% ± 2.3）和EM CD8⁺（23.6% ± 2.4 vs 11.3% ± 2.0）细胞比例显著更高。因此，EM:na?ve比值在Group 2的CD4⁺和CD8⁺细胞中也均显著更高，并显示出卓越的预后价值（CD8⁺ AUC: 0.946, p<0.001）。viSNE分析再次验证了PB中Group 2患者HLA-DR表达升高以及EM细胞增多、na?ve细胞减少的趋势。

CD14⁺细胞极化状态的评估显示其预后价值有限

通过分析CD80（M1标志物）、CD206和CD163（M2标志物）的表达来评估MM的极化状态。在SF和PB中，表达CD163的M2样细胞都是最主要的亚群。虽然Group 2患者PB中表达CD80（M1）和CD80⁺/CD163⁺（混合M1/M2）表型的细胞有更高趋势，但所有极化亚群的比例在两组间均无统计学差异，表明MM的极化状态在诊断时不能作为疾病扩展的生物标志物。

CD14⁺细胞上的TREM-1表面表达及PB和SF中的sTREM-1水平可区分不同临床病程的患者

TREM-1是髓系细胞上一个重要的炎症放大受体。研究发现，Group 1患者SF中TREM-1⁺ CD14⁺细胞的比例显著高于Group 2（90.47% ± 1.11 vs. 83.6% ± 3.3）。相反，Group 2患者SF中的sTREM-1浓度却显著更高（8926 ±1282 pg/ml vs 5822 ±931.6 pg/ml）。在PB中也观察到类似的趋势：Group 2的TREM-1⁺细胞比例更低（40.16% ± 9.079 vs 53.21% ±10.59），而sTREM-1水平显著更高（298.8 ±20.45 pg/ml vs 232.0 ±21.01 pg/ml）。这表明膜结合TREM-1表达降低和sTREM-1水平升高可能与疾病扩展风险相关。

SF来源EV的表面标志物表达谱鉴定出潜在的疾病扩展生物标志物

使用MACSPlex试剂盒对SF来源的EV进行表面蛋白分析。两组患者均检测到经典的EV标志物（如CD9, CD81, CD63）和多种免疫相关抗原。比较发现，Group 1患者EV上的HLA-ABC（98.72 ± 14.2 vs 34.1 ± 20）和CD3（26.49 ± 11.34 vs 0.98 ± 0.08）表达水平显著高于Group 2。ROC曲线分析显示，这两个标志物具有很高的区分能力（HLA-ABC AUC = 0.857, p=0.012；CD3 AUC = 0.949, p<0.001）。

免疫学标志物与临床特征的组合用于早期风险分层

研究评估了组合生物标志物的判别效能。将SF中的CD3:CD14比值、EV的HLA-ABC和CD3水平组合，以及将PB中的HLA-DR⁺ T细胞百分比、na?ve和EM细胞比例、EM:na?ve比值组合，通过广义线性模型（GLMNET）和留一法交叉验证（LOOCV）进行分析。这两个免疫组合模型都表现出完美的判别性能（AUC = 1.0, p<0.001）。相比之下，将显著不同的临床参数（ESR、活动关节数、对称性）组合的模型判别能力较低（AUC = 0.857, p=0.004）。这表明组合免疫学标志物在早期风险分层上可能优于单纯的临床指标。

讨论

本研究首次全面表征了新发Oligoarthritis患者SF和PB中T细胞与MM的免疫表型及其与EV表面蛋白的关联，并前瞻性地鉴定出多个与两年内多关节扩展风险相关的早期免疫生物标志物。研究发现，高风险患者（Group 2）在疾病初期就表现出更强的系统性（PB）和局部（SF）T细胞活化（HLA-DR⁺）、向效应记忆表型偏移（更高的EM:na?ve比值）以及独特的EV表面蛋白谱（更低的HLA-ABC和CD3）。同时，sTREM1水平升高和膜TREM1表达降低也提示了先天免疫的异常。这些发现揭示了疾病扩展的早期免疫机制，即潜在的全身性免疫失调和持续的局部炎症驱动。虽然临床参数（如多关节受累、高ESR）已有提示作用，但本研究确定的免疫组合标志物显示出更高的判别准确性（AUC 1.0）。如果能在更大规模的前瞻性队列中得到验证，这些标志物有望成为临床实用的工具，实现对Oligoarthritis患者的早期风险分层，从而抓住治疗“机会窗”，更早地启用改善病情的抗风湿药物（DMARDs），预防关节损伤和疾病扩展，最终改善长期预后。研究的局限性包括样本量较小、缺乏外部验证队列以及治疗异质性可能的影响。未来的大规模、多中心研究将是验证和推广这些发现的关键。