三种品牌血培养瓶抗生素吸附能力对比研究及其在ICU患者血流感染诊断中的临床价值评估

本研究比较了BacT/ALERT、BD BACTEC和VersaTREK三种血培养系统对万古霉素、头孢哌酮/舒巴坦等抗生素的吸附能力。结果显示BacT/ALERT系统在阳性检出率（64.3%）、报阳时间（TTD）和抗生素中和能力方面具有显著优势（P<0.05），特别适用于已接受抗生素治疗的患者，为ICU血流感染（BSI）诊断提供了重要依据。

　　

1 引言

血流感染（BSIs）是全球范围内的重要公共卫生问题，其死亡率较高。快速准确的病原学诊断能够使患者及时获得有效的抗菌治疗，对降低BSIs死亡率具有重要意义。尽管新的微生物鉴定技术不断发展，血培养仍是诊断BSIs的金标准，应在开始抗菌治疗前对疑似BSIs患者进行血培养采集。然而全球调查显示，在抗生素使用前对潜在严重感染患者采集血培养的依从率较低。对于ICU患者，医生常在血培养结果出来前就经验性使用抗生素。值得注意的是，在抗生素治疗期间获得的血培养阳性率会降低20%。商业血培养瓶通常建议在仪器中培养5天，导致检测时间延长，不利于及时优化患者治疗方案。

一些商业血培养培养基含有抗生素吸附物质，如树脂或活性炭，以尽量减少抗生素对血培养中微生物生长的抑制。本研究比较了三种商业自动化血培养系统（BacT/ALERT、BD BACTEC和VersaTREK）的抗生素吸附能力，并评估了模拟血培养中各种抗生素-细菌组合的检出率和报阳时间（TTD）。同时还比较了2022年6月至2023年6月综合ICU患者阳性血培养检出率和检出细菌类型。

2 材料与方法

2.1 血培养培养基和仪器

使用含树脂的BacT/ALERT FA Plus（FA Plus）需氧瓶和FN Plus（FN Plus）厌氧瓶，配套BacT/ALERT 3D血培养系统（生物梅里埃，法国）。使用含树脂的BD BACTEC Aerobic/F Plus（BD需氧Plus）瓶和无树脂的Lytic/10 Anaerobic/F（BD裂解/10厌氧）瓶，配套BD BACTEC FX血培养系统（贝克顿迪金森公司，美国）。使用VersaTREK需氧瓶和厌氧瓶，配套Thermo Scientific VersaTREK系统（赛默飞世尔科技，美国）。本研究中的三台血培养仪器于2015年5月10日开始使用，每年进行一次性能验证，最近两次验证分别于2022年7月26日和2023年7月26日进行。

2.2 菌株

根据实验室阳性血培养检出率选择微生物种类，使用以下ATCC菌株（来自美国模式培养物集存中心）：大肠埃希菌ATCC 25922；铜绿假单胞菌ATCC 27853；甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌ATCC 29213；肺炎链球菌ATCC 49619。将标准菌株接种到哥伦比亚血琼脂平板两次，37°C培养18-24小时。取单个菌落用生理盐水制备0.5麦氏标准浊度的菌悬液，并依次进行倍数稀释制备最终浓度为100菌落形成单位（CFU）/mL的菌液。通过多次稀释法制备100 CFU/mL浓度的菌悬液：首先挑取单个菌落，用生理盐水制备0.5麦氏标准浊度的菌悬液，此时菌浓度约为10⁸ CFU/mL；然后取三个无菌样品管，依次编号为1、2、3，分别加入9.9 ml、9.9 ml和11.88 ml生理盐水；将100 μL制备好的0.5麦氏标准菌悬液转入管1，混合后管1中的菌悬液含10⁶ CFU/mL；接着将100 μL管1中的菌悬液转入管2，获得浓度为10⁴ CFU/mL的悬液；最后将120 μL管2中的菌悬液加入管3，获得浓度为100 CFU/mL的悬液。每组实验制备12 ml菌悬液备用。取0.3 mL稀释菌悬液接种到哥伦比亚血琼脂平板上，37°C培养过夜以验证CFU。

2.3 抗生素

本研究选择了治疗模拟BSIs最常用的四种抗菌药物。购买抗生素粉末包括亚胺培南（MB1457-S）、头孢哌酮（MB1805-1）、舒巴坦（MB5725-S）、青霉素（MB2047-S）和万古霉素（MB1260-S）（来自中国美仑生物）。根据说明书选择合适的溶剂。根据《桑福德抗微生物治疗指南》中抗生素的峰值血清浓度计算实验用抗生素浓度，并制备实验用抗生素溶液。

2.4 血培养制备

在模拟血培养实验中，向每个血培养瓶中加入10 mL无菌马血（来自英国Oxoid Limited）、0.3 mL制备的菌悬液和0.3 mL抗生素溶液。对于每种细菌-抗生素组合，对不同类型的血培养瓶进行五次重复实验。此外，为每个组合设置不含抗生素的阳性对照，每个对照组三个重复。随后将培养瓶放入血培养仪中培养，记录五天内不同瓶子的阳性报警和检测时间。阴性结果为血培养在五天内未检测到细菌生长信号，阳性结果为在五天内检测到细菌生长信号并报警。所有阳性血培养都传代培养到哥伦比亚血琼脂平板上过夜培养，并使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对分离的细菌进行鉴定。

2.5 数据分析和统计

使用GraphPad Prism 6进行统计分析。使用Fisher精确检验比较三种培养系统在需氧和厌氧培养基中的检出率。使用Mann-Whitney检验分析比较TTD。P值<0.05被认为有统计学意义。

3 结果

评估了210个BacT/ALERT（FA Plus和FN Plus）、BD BACTEC（Aerobic/F Plus和Lytic/10 Anaerobic/F）和VersaTREK（需氧和厌氧）血培养瓶的抗生素吸附功能。BacT/ALERT系统的检出率为45/70（64.3%），BD BACTEC系统为25/70（35.7%），VersaTREK系统为13/70（18.6%）。在不含抗生素的阳性对照中，所有细菌均被检出。对于需氧瓶，BacT/ALERT系统和BACTEC系统的检出率均为25/35（71.4%），而VersaTREK系统的检出率为12/35（34.3%）（P=0.047）。在厌氧瓶中，BacT/ALERT系统未检测到阳性瓶，VersaTREK系统仅检测到1/35（2.9%），但BacT/ALERT系统的检出率高于其他两个系统，为20/35（57.1%）（P=0.018）。为确保实验中使用的抗生素活性，将抗生素溶液和菌悬液在VersaTREK需氧瓶和厌氧瓶中共同孵育，结果显示所有培养瓶均无细菌生长（数据未显示）。

头孢哌酮/舒巴坦和青霉素在BacT/ALERT培养基中的回收率均为100%。头孢哌酮/舒巴坦在BACTEC和VersaTREK培养基中的回收率分别为10/20（50%）和6/20（30%）。结果显示三种血培养系统中需氧瓶和厌氧瓶的头孢哌酮/舒巴坦回收率存在显著差异（P<0.05）。青霉素在BACTEC和VersaTREK系统中的回收率分别为5/10（50%）和2/10（20%），同样，三种血培养系统中青霉素的回收率也存在显著差异（P<0.05）。万古霉素在BacT/ALERT培养基中的回收率较高，为15/20（75%），而在BACTEC和VersaTREK培养基中的回收率分别为10/20（50%）和3/20（15%）。亚胺培南在三种血培养系统中的回收率最低，在BacT/ALERT系统中的回收率为5/20（25%），但在BACTEC和VersaTREK系统中均未回收。以上结果表明BacT/ALERT系统的抗生素回收率高于BACTEC和VersaTREK系统。

在三种需氧培养系统中共检测到五种微生物-抗生素组合。其中，BacT/ALERT系统在三种（60%）微生物-抗生素组合中的TTD短于其他两种系统。BacT/Alert FA Plus瓶的TTD（24.4小时）比BD BACTEC Aerobic/F Plus瓶（29.5小时）短5.1小时，比VersaTREK需氧瓶（58.5小时）短34.1小时（P=0.363）。在三种厌氧培养系统中也检测到五种微生物-抗生素组合，其中四种由BacT/ALERT系统检测到；所有四种组合的TTD均<30小时。BacT/Alert FN Plus瓶的TTD为17.6小时，比VersaTREK厌氧瓶的TTD（13.1小时）长4.5小时（P=0.033），而VersaTREK厌氧瓶仅检测到一种微生物-抗生素组合。BacT/Alert FN Plus瓶检测到四种组合，而BD BACTEC Lytic/10厌氧瓶未检测到任何组合。

总结了血培养瓶微生物-抗生素组合与无抗生素对照的TTD差异（△TTD）。对于革兰阴性菌，在BD BACTEC系统中观察到大肠埃希菌-头孢哌酮/舒巴坦的△TTD超过8小时，在VersaTREK系统中观察到大肠埃希菌-头孢哌酮/舒巴坦和铜绿假单胞菌-头孢哌酮/舒巴坦的△TTD超过8小时。对于革兰阳性菌，在BacT/ALERT系统中观察到肺炎链球菌-万古霉素和肺炎链球菌-青霉素的△TTD超过8小时；在BD BACTEC系统中观察到金黄色葡萄球菌-万古霉素、肺炎链球菌-万古霉素和肺炎链球菌-青霉素的△TTD超过8小时；在VersaTREK系统中观察到肺炎链球菌-万古霉素和肺炎链球菌-青霉素的△TTD超过8小时。此外，发现铜绿假单胞菌在VersaTREK厌氧瓶中被检测到，可能是由于瓶内厌氧环境较差所致。

上述研究表明BacT/ALERT系统血培养瓶对抗生素表现出更好的吸附和中和能力，导致微生物-抗生素组合中细菌阳性的检测时间更短。回顾性分析数据显示，综合ICU中VersaTREK系统的血培养送检数量高于其他科室。因此选择2023年6月在综合ICU使用一个月的BacT/ALERT系统血培养瓶，然后比较2022年6月使用VersaTREK系统与2023年6月使用BacT/ALERT系统在综合ICU的血培养结果。2023年6月共检测综合ICU的151对血培养瓶，检测到18对阳性血培养，检出率为11.92%，包括10种菌株，共28株菌。2022年6月共检测110对血培养瓶，检测到10对阳性血培养，检出率为9.10%，包括8种菌株，共19株菌。在检测到的革兰阴性菌中，BacT/ALERT系统的平均TTD为19.02小时，而VersaTREK系统的平均TTD为18.29小时。革兰阳性菌的平均TTD在BacT/ALERT和VersaTREK系统中分别为22.25小时和35.87小时。以上结果表明BacT/ALERT系统的检出率高于VersaTREK系统，且BacT/ALERT系统对革兰阳性菌的TTD短于VersaTREK系统。值得注意的是，两种系统对革兰阴性菌的TTD差异不显著。

进一步比较了两种系统检测到的菌株。2022年VersaTREK系统检测到的最高菌株类型是表皮葡萄球菌，检测到五次，其次是人葡萄球菌和屎肠球菌，均检测到三次。2023年BacT/ALERT系统检测到的最高菌株是表皮葡萄球菌，检测到七次，而鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌和头状葡萄球菌均检测到三次。结果表明BacT/ALERT系统检测到的菌株类型和数量均多于VersaTREK系统。

统计了2022年6月和2023年6月综合ICU血培养阳性患者数量，并回顾性分析了他们的病例。统计显示，2022年6月使用VersaTREK系统检测的患者中，10例患者血培养阳性，其中5例死亡，其中3例在血培养结果报告前死亡。2023年6月使用VersaTREK系统检测的患者中，17例患者血培养阳性，其中8例死亡，其中4例在血培养结果报告前死亡。由于样本量有限，无法得出结论认为使用VersaTREK系统进行血培养检测能使患者立即接受治疗并降低死亡率。

4 讨论

尽管新的微生物技术不断发展，血培养仍是诊断BSIs的金标准。当前，日益增加的耐药性导致严重感染发生率更高，提供及时有效的抗菌药物治疗比以往任何时候都更加重要。根据指南最佳实践声明，建议对疑似BSIs患者在开始抗菌治疗前进行血培养。在本研究中，通过模拟BSIs患者血液标本比较了三种血培养系统的检出率，BacT/ALERT系统具有最高的检出率。ICU患者通常病情较重，本研究通过查阅病例发现，在采集血培养前已给予经验性抗生素治疗。全球调查也显示抗生素使用前采集血培养的依从率较低。早期抗生素治疗可能会缩短治疗时间，预防感染性休克，有助于降低BSIs患者的死亡率。然而研究表明，在抗菌治疗前血培养阳性的情况下，经验性给药后血培养的检出率降低了50%。因此在本研究中还模拟了抗生素治疗后BSIs患者的血液标本，比较了三种血培养系统产生的抗生素回收率。结果明确显示，相对于VersaTREK和BACTEC系统，BacT/ALERT系统具有更高的检出率和更短的抗生素检测时间。血液中含有的抗体、补体、吞噬细胞、溶菌酶和抗菌因子会抑制或杀死病原微生物，也会影响血培养的阳性检出率。为尽量减少血液成分对检出率的影响，目前商业血培养瓶含有基本营养素以及其他成分，如抗凝剂，可防止吞噬作用，抑制补体和淋巴细胞活性，并降低氨基糖苷类和多粘菌素的活性。添加树脂或活性炭可吸附血液中的游离抗菌药物并促进细菌生长。此外，添加溶血素可裂解细胞，促进细胞内感染微生物的释放，并稀释血液中抗生素的浓度，提高阳性检出率。本研究中使用的三种血培养瓶中，BacT/ALERT培养基和BACTEC培养基含有树脂和抗凝剂，VersaTREK培养基含有溶血素。结果表明，含树脂和抗凝剂的培养基比含溶血素的培养基对抗生素的回收效果更好。很明显，BacT/ALERT系统相比其他两种系统具有更高的检出率和更短的检测时间。此外，使用BacT/ALERT培养基从综合ICU患者采集的血培养检出率和检测菌种数量均高于使用VersaTREK培养基。两种培养基对革兰阴性菌的检测时间无显著差异，而BacT/ALERT培养基对革兰阳性菌的检测时间显著短于VersaTREK培养基。因此，在抗生素治疗后采集血培养的情况下，选择适当的血培养瓶对于提高阳性检出率和TTD至关重要。当然仍然建议尽可能在抗生素治疗前采集血培养，以促进抗菌治疗的有效性和治疗方案的安全降级。对于ICU患者或具有严重BSIs表现的患者，建议在采集血培养后尽快开始抗菌治疗。

血培养污染（BCC）是血培养过程中最严重的问题之一，给患者带来一定风险，如一些不必要的抗菌治疗和住院费用。污染物是在标本采集或处理过程中进入培养基的任何对患者无致病性的微生物。根据多年研究，从血液中分离出的最可能代表污染的微生物包括大多数凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）、大多数棒状杆菌属、芽孢杆菌属（不包括炭疽芽孢杆菌）、微球菌属和丙酸杆菌属。图表还显示BacT/ALERT和VersaTREK血培养系统检测到的CoNS数量较多，如表皮葡萄球菌和人葡萄球菌。病例回顾显示，一些患者针对检测到的CoNS接受了靶向抗菌治疗。多项研究发现，因BCC开始抗生素治疗的患者接受治疗的时间更长。这可能导致抗生素暴露增加，可能引起抗生素耐药性的出现并破坏患者体内的微生物群稳定性。污染可能由于采样不当、未遵循严格无菌操作、采血区域（如急诊科）人员过多和拥挤，或从儿童和老年患者采血困难。因此建议严格按照指南进行皮肤消毒，加强对护士的培训，遵循血培养采集过程中的无菌原则。应注意在采集血培养前使用70%异丙醇消毒血培养瓶顶部。采集后应立即送实验室检测。此外，应尽早对疑似BSIs的重症患者进行血培养。如表所示，2022年6月至2023年6月期间，综合ICU血培养阳性患者中约30%在获得血培养结果前死亡，这也可能与患者的基础疾病、病情和年龄有关。

5 结论

尽管本研究存在一些局限性，但清楚表明BacT/ALERT系统在检出率和时间方面具有一定优势，并对所研究的大多数抗生素具有优异的吸附能力。对于抗生素治疗后采集血培养的患者，应尽可能选择具有更好抗生素吸附或稀释能力的血培养瓶。尽管早期给予危重患者抗生素有益，但应在使用抗生素前采集血培养，以防止抗生素耐药性的发展并增加患者住院时间。此外，应加强医生和护士培训，严格执行无菌操作程序，为患者提供最佳治疗方案。