开发并验证了一种新型的UPLC-Q-Orbitrap HRMS方法，用于测定血液中的对硝基苯胺及其代谢物

《Frontiers in Chemistry》：Development and validation of a novel UPLC-Q-Orbitrap HRMS method for determining p-Nitroaniline and its metabolites in blood

准确可靠同时检测对硝基苯胺及其代谢产物的血样方法基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术，经方法验证表明灵敏度（0.6-2.2μg/L）和准确性（83.1%-101.3%）满足要求，并成功应用于职业暴露人群的生物监测。

　　在工业生产与日常生活中，p-硝基苯胺（p-NA）作为一种重要的化工原料，被广泛应用于染料、农药、成像材料以及制药等多个领域。随着p-NA在国内外的广泛应用，其职业暴露问题日益受到关注。特别是在中国，由于其在全球p-NA产业链中的重要地位，既是主要生产国也是主要消费国，因此职业暴露人群数量庞大，暴露风险相对较高。然而，目前针对p-NA及其代谢产物在血液中的系统性定量分析方法仍较为缺乏，这限制了对其职业暴露的科学评估。本研究旨在开发一种准确、可靠且灵敏的检测方法，用于同时测定p-NA及其代谢产物在血液中的含量，为职业暴露评估提供坚实的技术基础。

p-NA具有较强的生物活性，可通过皮肤接触或吸入其粉尘和蒸汽进入人体，对人体健康造成潜在威胁。其主要毒理作用包括诱导高铁血红蛋白形成、破坏红细胞结构、引发溶血性贫血，并可能对肝脏和肾脏造成损害。此外，有研究表明，p-NA还可能通过皮肤吸收产生致癌风险。因此，准确评估个体对p-NA的内部暴露水平，是控制其职业健康风险的重要手段。通过检测血液中的p-NA及其代谢产物，可以更加全面和真实地反映人体实际接触的剂量水平。然而，现有的研究方法往往缺乏系统性和详细的技术验证，难以满足实际应用的需求。

本研究采用了一种基于超高效液相色谱（UPLC）与四极杆-轨道阱高分辨率质谱（Q-Orbitrap HRMS）联用的分析技术，开发了一种新型的血液检测方法。该方法通过有机溶剂萃取，将目标物质从血液中分离出来，再通过UPLC进行分离，最终利用HRMS进行高灵敏度和高分辨率的定量分析。与传统的三重四极杆质谱（Triple Quadrupole MS）相比，轨道阱质谱在分辨率和质量精度方面具有显著优势，能够有效排除复杂基质中可能干扰检测结果的成分。同时，其扫描速度极快，能够在高分辨率条件下保持良好的定量性能，确保检测结果的准确性。

在方法开发过程中，研究人员对多种固相萃取（SPE）和液液萃取（LLE）技术进行了系统评估。结果显示，尽管某些SPE柱在水溶液体系中表现出较好的提取回收率，但在血液样本中，由于基质效应较强，p-NA的代谢产物如对苯二胺（p-PD）和对氨基乙酰苯胺（p-AAA）的信号强度显著下降，甚至难以检测。相比之下，LLE方法在提取效率方面表现更优，尤其在p-NA及其代谢产物的检测中显示出更高的回收率。因此，研究人员选择了乙酸乙酯作为萃取溶剂，并优化了萃取体积，最终确定3.0 mL为最佳萃取体积。这一优化过程不仅提高了检测的灵敏度，也确保了方法的实用性。

为了进一步提高分离效果，研究人员对色谱柱进行了深入研究，并选择了ACQUITY UPLC? BEH Shield RP18色谱柱。该色谱柱采用了独特的Shield键合相与桥接乙基混合技术，能够有效提升碱性化合物的分离效率和峰形对称性。同时，通过优化流动相组成和梯度洗脱程序，确保了所有目标物质在色谱分离过程中均能获得良好的分离效果和信号强度。这一过程不仅提高了检测的准确性，也增强了方法的适用性。

在方法验证阶段，研究人员对多个关键参数进行了系统评估，包括线性关系、灵敏度、选择性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率以及样品的稳定性。实验结果表明，在1–100 μg/L的浓度范围内，所有目标物质均表现出良好的线性关系，相关系数（r）均超过0.999，说明该方法在定量分析方面具有较高的可靠性。此外，方法的灵敏度也得到了充分验证，所有目标物质的检测下限（LLOD）和定量下限（LLOQ）均处于0.6–2.2 μg/L和2.0–7.4 μg/L之间，满足实际检测的需求。方法的准确度和精密度同样表现优异，所有目标物质在不同浓度水平下的回收率均在83.1%至101.3%之间，日内和日间变异系数（CV）均低于9.9%和8.7%，符合相关分析方法验证指南的要求。

基质效应是影响检测结果准确性的关键因素之一。研究人员通过比较在空白血浆和溶剂中目标物质的峰面积，评估了基质效应的程度。结果显示，所有目标物质的基质效应均在78.2%至107.5%之间，表明基质对检测结果的影响较小。同时，提取回收率也表现出良好的一致性，所有目标物质的回收率均在77.3%至99.3%之间，进一步证明了该方法在实际应用中的可行性。

在样品稳定性方面，研究人员对不同存储条件下的血样进行了检测。结果显示，在-80 ℃下保存20天后，所有目标物质的降解率均低于15%，表明血样在低温保存条件下具有良好的稳定性。而在室温下保存2小时或4 ℃下保存24小时后，目标物质的降解率同样控制在可接受范围内，说明该方法在短期样品处理中也具有良好的适用性。

为了验证该方法的实际应用效果，研究人员选取了15份来自不同职业背景的血液样本进行检测。其中，10份样本来自长期接触p-NA的工人，5份样本来自从未接触p-NA的管理人员。结果显示，接触p-NA的工人血液中p-NA及其代谢产物的浓度显著高于管理人员，表明该方法能够有效区分暴露与非暴露人群的内部暴露水平。此外，不同代谢产物的浓度分布也反映出人体对p-NA的代谢过程，为进一步研究其代谢路径提供了数据支持。

综上所述，本研究开发的基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术的检测方法，在灵敏度、准确度和精密度方面均表现出色，能够满足对p-NA及其代谢产物在血液中的系统性定量分析需求。该方法不仅适用于职业暴露人群的生物监测，也为进一步研究p-NA的代谢机制和健康影响提供了可靠的技术手段。未来，随着该方法的广泛应用，有望为职业健康防护和环境监测提供更加科学的依据，推动相关领域的研究进展。