IS26动员对多重耐药鲍曼不动杆菌基因操作的影响及其在IC2进化成功中的关键作用

本综述深入探讨了插入序列IS26在多重耐药（MDR）鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii），特别是国际克隆2（IC2）中的活跃转座行为如何显著阻碍传统的基因敲除技术（如同源重组）。研究揭示了IS26通过其独特的共整合机制“劫持”电穿孔导入的自杀性质粒，整合至基因组非目标区域，并介导筛选过程中的假阳性耐药（如pitA基因插入失活）。研究同时发现，通过自然转化和接合转移可有效规避此干扰，成功实现comA和xcpW基因敲除。该发现对理解IC2的成功进化及针对耐药菌的基因编辑策略具有重要启示。

　　

引言

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种革兰氏阴性医院获得性病原体，因其不断升级的抗生素耐药性和在危重患者中的高死亡率而受到广泛关注。作为最令人担忧的多重耐药（MDR）ESKAPE病原体之一，鲍曼不动杆菌因其多重内在和获得性耐药机制对治疗构成重大挑战，这些机制导致了多重耐药（MDR）、广泛耐药甚至全耐药表型的出现。因此，世界卫生组织（WHO）将碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌列为“优先级1：关键组”以进行研究。

鲍曼不动杆菌分离株的种群结构非常多样；然而，只有少数特定的克隆，称为国际克隆谱系（IC），在全球分布。碳青霉烯类耐药性的广泛传播很大程度上可归因于两个主要克隆的增殖，即国际克隆1（IC1）和国际克隆2（IC2）。IC2，根据巴斯德多位点序列分型（MLST）方案命名为ST2，仍然是鲍曼不动杆菌最主要和分布最广的克隆。

鲍曼不动杆菌中已有许多耐药机制被记录，但我们目前对该生物的理解仍然有限。这一局限性主要源于许多当代基因编辑工具和实验方案是使用模式菌株开发和优化的，这些模式菌株可能无法准确代表当前临床环境中遇到的问题克隆谱系。因此，当这些方法应用于MDR临床分离株时，可能会出现意想不到的困难。

对于鲍曼不动杆菌，常规的基因删除策略通常采用涉及整合和切除的两步法。该过程利用一个特殊构建的自杀敲除载体，该载体包含同源区域以及用于等位基因交换筛选的选择和反选择标记。抗生素抗性基因是最常用的可选择标记；然而，它们不适用于MDR菌株。替利霉素抗性操纵子（telR），由三个连续基因——kilA、telA和telB组成，已被报道可作为针对鲍曼不动杆菌分离株的敲除质粒的有效选择标记，无论其抗生素耐药性如何。

IS26在革兰氏阴性菌中传播抗生素抗性基因方面起着关键作用。它编码DDE转座酶Tnp26，该酶具有独特的特性。IS26不是独立移动到新位置，而是通过一种专门在两个DNA分子之间形成共整合体的机制进行转座。该过程产生一种结构，包括一个IS拷贝和一个称为可转座单元（TU）的相邻DNA片段，融合到一个靶分子上，从而通过两个直接定向的IS26拷贝产生所谓的伪复合转座子（PCT）结构。当靶位点缺乏IS26时，第二个IS拷贝是通过称为“复制进入”模式的复制步骤产生的，导致8 bp的靶位点重复（TSD）。相反，当靶标已经含有IS26时，Tnp26介导的共整合体形成可以通过保守途径发生，其中IS和靶位点都不发生重复。这些共整合体随后可以通过同源重组过程进行解析，产生两个复制子——每个都携带一个IS拷贝。此外，IS26可以作用于同一个DNA分子，导致位于其自身和其靶位点之间的DNA缺失或倒位。

在本研究中，我们选择了一株MDR临床分离的IC2鲍曼不动杆菌HN85，并利用各种转化方法进行基因敲除实验，以阐明阻碍经典基因敲除技术的因素。观察到了IS26转座的参与。鉴于IS26在革兰氏阴性菌中广泛分布，理解其活跃转座对基因编辑的影响具有重要意义。

材料与方法

本研究使用的细菌菌株和质粒详见表1。鲍曼不动杆菌菌株HN85和W068是从一项评估鲍曼不动杆菌临床分离株的抗菌素耐药性和自然转化能力的调查中筛选出来的。所有菌株都是野生型临床分离株鲍曼不动杆菌HN85或W068的衍生物。细菌在溶原性肉汤（LB）中培养。为了选择目的，生长培养基中补充了亚碲酸钾（30 mg/L）、卡那霉素（50 mg/mL）或泽奥霉素（250 μg/mL）。

使用的质粒列表见表1。所有衍生质粒均使用基于重叠延伸PCR技术的无缝克隆策略构建（pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit, TRAN）。本研究使用的引物见补充表S1。使用适当的引物扩增靶基因周围约800-1000 bp的侧翼区域，这些引物设计用于删除靶基因的大部分序列，同时仅保留3'端的最后25-48个核苷酸。pMo130-Tel^R载体用作telR扩增的PCR模板，而pGEM-sacB和pMo130-Tel^R的载体骨架使用含有与靶基因侧翼区域互补区域的引物进行扩增。

通过电穿孔、自然转化或接合方法将质粒转入鲍曼不动杆菌分离株，随后在补充有亚碲酸钾（30 mg/L）或卡那霉素（50 mg/mL）的LB平板上进行选择。通过使用引物tel-NF/NR检测TelR盒或KF/KR检测kanR标记的PCR，在至少经过三次重新培养循环后，验证含有转移质粒的转化子。通过使用位于同源区域外和选择标记内的适当引物进行PCR和测序，验证质粒插入的位置。对于显示正确质粒整合的转化子，最终的敲除突变体在补充有10%蔗糖和亚碲酸钾（30 mg/L）的LB琼脂上进行反选择。通过PCR和测序最终确认基因缺失。

采用短读长和长读长混合测序策略构建野生株HN85、W068及几个转化子的完整基因组。简而言之，短读长测序数据通过Illumina HiSeq PE150双末端测序策略生成。长读长测序数据根据制造商的说明从Oxford Nanopore MinION平台获得。使用Unicycler进行混合组装。

使用Prokka进行基因组序列的预测和注释。通过ISFinder鉴定IS元件，遵循当前定义亚型的标准，要求与数据库中任何其他IS共享>98%的氨基酸相似性和/或>95%的核苷酸一致性。使用Mauve v2.4.0渐进比对构建菌株间的全基因组比对。从NCBI基因组数据库下载了931个鲍曼不动杆菌完整基因组，并通过BLAST分析分析了这些基因组中IS26的存在和多样性。只有完整的IS26拷贝被纳入分布统计。根据巴斯德方案进行MLST，然后进行eBURST分析以评估所选基因组的种群结构。克隆复合体（CC）定义为一组由创始ST及其单一位点变体组成的集合。

如先前所述测试细菌的自然转化能力。供体DNA pOri是一个穿梭质粒，通过将pWH1266复制起点区域的PCR产物克隆到pCR-Blunt II-TOPO中构建。pCR-Blunt II-TOPO的泽奥霉素抗性盒用作选择标记。

HN85、W068、HN85_ET^xcpW、HN85_ET^comA、HN85_NT、HN85_SR^xcpW和W068_IS26_S的基因组序列已存入GenBank（BioProject PRJNA1264468），登录号为CP194389、CP194656-CP194660、CP194388、CP194387、CP194385、CP194386和CP194651-CP194655。

结果

HN85和W068中IS元件的分布

在我们先前涉及敏感临床菌株鲍曼不动杆菌W068的基因敲除研究中，所有电穿孔的自杀质粒都通过同源重组成功整合到靶位点。然而，在分离株HN85中未实现这种整合，原因是IS元件的招募（详情如下）。基因组测序显示，HN85和W068的染色体长度分别为3,975,818 bp和3,735,903 bp。W068菌株含有四个质粒，大小分别为13,276 bp、10,295 bp、9,656 bp和3,861 bp。

利用ISFinder BLAST followed by manual examination，我们鉴定出W068中插入序列（IS）元件的密度更高，有100个拷贝，显著超过了Adams等人估计的每个鲍曼不动杆菌基因组平均33个IS拷贝的估计值。相比之下，HN85只有35个拷贝。一些IS拷贝显示出截断或移码突变。我们在W068中鉴定出12个完整的IS，总计90个拷贝；在HN85中鉴定出8个完整的IS，总计34个拷贝。只有ISAba26和ISAba22存在于两个基因组中。

BLAST分析表明，在菌株HN85中鉴定出的大多数IS元件也存在于各种非不动杆菌的革兰氏阴性菌中，包括三个最普遍存在的元件：ISAba1、IS26和ISAba14。在W068中发现的两种新型IS已根据提交给ISFinder数据库的情况命名为ISAba74（IS5家族）和ISAba75（IS3家族）。这些元件也存在于其他几种鲍曼不动杆菌和不动杆菌属菌株中；然而，在该属之外没有鉴定出高度同源的对应物。

分离株HN85包含一个截断的拷贝和九个完整的IS26拷贝，其中七个聚集在一个特定区域内。位于这个IS26富集区域内的大多数非IS26基因与W068中的基因相比是保守的，除了氨基糖苷类抗性基因armA。六个远距离的假基因对应于分布在该区域的三个基因，这些基因在图2中用不同颜色的线表示。虽然TSD通常被认为是转座事件的指纹，但没有观察到任何一个IS26拷贝两侧有匹配的TSD对。然而，在两个不同的IS26拷贝的一端检测到相同的TSD（在图2中用蓝色旗帜标记），其中一个拷贝含有两个额外的胞嘧啶核苷酸。对于IS26转座，TSD通常位于进入复制子的两侧；然而，位于这些相同TSD之间的三个片段显示出相互重叠，表明在IS26插入后可能存在多次序列倒位。

IS26介导的电穿孔质粒整合

在我们之前的研究中，我们在W068中构建了33个单基因敲除突变体。我们假设，用telR替换W068自杀载体中的卡那霉素抗性标记（kanR），将有助于使用相同的敲除方案在MDR分离株中进行基因删除。质粒pGEM-xcpW被设计为这样的载体，以敲除T2SS次要假菌毛组装启动复合体 competence protein XcpW。将该质粒电穿孔到MDR分离株HN85后，许多菌落在亚碲酸钾选择平板上生长；然而，只有一个显示出telR扩增，命名为HN85_ET^xcpW。但是，使用位于xcpW侧翼区域外的引物进行PCR，产生的产物长度与野生型相同，表明整合发生在目标位置之外。基因组测序进一步揭示，插入的质粒位于上述IS26富集区域内最后一个IS26拷贝（ACRRTD_06510）附近，并且在其另一侧包含一个额外的IS26拷贝，从而形成了一个PCT结构，这代表了IS26“复制进入”转座机制产生的经典结构。产生的TSD在其预期位置被发现，并在图2中用红色旗帜标记。

我们还构建了两个含有oriT的敲除质粒：pMo130-xcpW和pMo130-comA。类似地，在用pMo130-comA电穿孔后，在亚碲酸钾选择平板上生长的大多数菌落未检测到质粒标记telR。质粒整合转化子被命名为HN85_ET^comA。基因组测序显示，该质粒整合在IS26富集区域内的另一个位置，两侧是一对匹配的TSD和两个直接定向的IS26拷贝。与HN85_ET^xcpW相比，在HN85_ET^comA中没有发现额外的IS26拷贝。插入位点的原始序列包含三个紧密连接的IS26拷贝，这使我们假设在质粒整合期间或之后发生了同源重组，导致一个IS26拷贝丢失。

IS26介导的基因组重组

为了阐明在选择平板上生长的非质粒整合菌落中观察到的亚碲酸钾抗性的机制，我们选择了一个菌落（HN85_NT）进行基因组测序。发现一个低亲和力无机磷酸盐转运蛋白基因（pitA）被一个新的IS26插入所中断，导致在IS26富集区域内的第一个IS26拷贝和这个新插入的拷贝之间发生了1,501,774 bp片段的倒位。

为了评估这些突变体对生存应激源的反应，我们在补充有10%蔗糖和30 mg/L亚碲酸钾的LB肉汤中培养HN85_ET^xcpW和HN85_ET^comA。产生的蔗糖抗性子克隆被命名为HN85_SR^xcpW和HN85_SR^comA。PCR分析和测序显示，在HN85_SR^comA和HN85_SR^xcpW中，分别由IS26转座引起了反选择标记sacB的插入失活和缺失。我们假设在HN85-ET^xcpW和HN85_SR^xcpW之间可能存在一种中间形式，该形式在HN85_ET^xcpW内整合质粒的下游同源区域包含一个新的IS26插入。这个中间体随后通过同源重组被解析，导致新插入的IS26拷贝以及位于两个IS26拷贝之间的DNA片段（包括一个预先存在的TSD）丢失，从而产生HN85_SR^xcpW。对于HN85_SR^comA，通过PCR测序证实了sacB因IS26转座而失活，因为PCR产物长度超过了对照。然而，PCR容易受到模板转换的影响。鉴于IS26的经典转座结构是由直接定向的IS26元件侧翼的，由于模板转换，存在无法扩增IS26拷贝之间内部序列的风险。尽管如此，即使在这种情况下，也足以确认sacB因IS26转座而插入失活。

通过自然转化和接合删除comA和xcpW

质粒pMo130-comA和pMo130-xcpW也分别通过自然转化和接合引入HN85。过夜培养后，亚碲酸钾选择平板上出现了许多菌落。大多数选定的菌落显示出telR的扩增；comA和xcpW侧翼区域外的引物没有显示扩增，证实了质粒整合，因为它们的大小（8,833 bp和8,998 bp）超过了本研究中使用的Taq聚合酶的扩增极限。在用蔗糖反选择后，我们最终实现了comA和xcpW的框内缺失。

我们之前的研究已经证实comA和xcpW对W068菌株的自然转化是必需的。然而，xcpW的缺失对HN85菌株的转化能力没有影响。相反，缺乏comA的敲除突变体完全丧失了转化能力。

IS26在鲍曼不动杆菌基因组中的分布

为了研究IS26在鲍曼不动杆菌基因组中的分布模式，我们分析了Genbank中存放的来自43个国家的931个完整基因组（截至2025年6月10日）。这些选定基因组的详细信息见补充表S2。根据相关参考文献，已经鉴定出几种IS26的次要变体，并基于此命名为IS26 v1-v4。这些变体相差一到三个核苷酸，导致转座酶中的单个氨基酸变化。其中三个变体在ISFinder数据库中列为IS15DI、IS15DII和IS15DIV。据报道，IS26 v1和v3的Tnp26中的G184N替换表现出增强的活性水平。本研究中观察到的所有转座实例都归因于IS26 v3。HN85包含七个IS26 v3拷贝，但只有两个野生型IS26拷贝；因此，很难排除高拷贝数可能产生的潜在影响。为清晰起见，我们统称所有次要变体为IS26。

MLST分析在931个基因组中识别出154种序列类型（ST）。完整形式的IS26存在于大约74.97%（698/931）的样本中，对应69种不同的ST。大多数（89.4%，624/698）仅携带染色体拷贝的IS26，而仅由质粒携带的只占7.4%。相比之下，针对皮特不动杆菌（A. pittii）和医院不动杆菌（A. nosocomialis）核心核苷酸数据库的BLAST分析分别仅发现9个和6个携带IS26的质粒；在这些密切相关的物种中未检测到染色体携带的IS26。

通过eBURST分析，将154个ST分为21个CC和65个singleton。CC1、CC2、ST229、CC15、CC79、CC78、CC25、CC23和CC85被报道属于九个已知的国际克隆谱系IC1-IC9。在每个谱系的分离株中检测到IS26的频率分别为67.9%、99.8%、100%、75%、91.7%、88.9%、28.9%、39.3%和12.5%。总共54.8%（510/931）的基因组被归类为属于IC2。值得注意的是，该组中的每个基因组都含有染色体IS26，拷贝数从1到21不等（平均：5）。然而，两个菌株（NIPH17_0019和VB1190）的所有染色体IS26拷贝都表现出移码突变，因此导致它们在补充表S3中被分类为缺乏染色体IS26。IS26在IC2菌株中的流行率甚至高于在鲍曼不动杆菌中最常遇到的IS元件ISAba1（505/510）。

W068中的IS26活性

菌株HN85包含九个IS26拷贝，这引发了一个问题：自杀质粒的招募是否仅仅是由于这些多重拷贝带来的机会增加。IS26富集区域中的最后一个拷贝被扩增并克隆到pEASY-T1中，产生质粒pIS26。该质粒与W068基因组没有同源区域，除了侧翼IS26的84 bp和20 bp片段。通过电穿孔，将pIS26引入W068，产生卡那霉素抗性转化子，命名为W068_IS26。为了促进共整合体的切除，同时仅保留一个IS26拷贝但消除整个质粒片段，在没有卡那霉素选择压力的情况下重新培养W068_IS26。卡那霉素抗性丢失以高频率发生（100%，n=20）；然而，在20个测试的卡那霉素敏感菌落中，只有一个命名为W068_IS26_S，保留了一个完整的IS26拷贝。测序显示，该拷贝仍然插入在10,295 bp的质粒中，通过中断一个编码假设蛋白的ORF（ACRRTB_18205）来实现。

选择质粒pGEM-sacB-?pilN用于电穿孔到W068_IS26_S中，该质粒先前已成功用于野生型W068中pilN的敲除。PCR证实，在选择平板上生长的所有测试菌落中都存在选择标记kanR。我们选择了16个菌落进一步检查插入位点。使用pilN侧翼区域外的引物进行PCR显示，8个菌落的扩增长度与野生型W068相同，表明质粒插入在靶区域之外。为了确认这一点，我们使用IS26侧翼引物（WF和WR）与质粒特异性引物配对进行PCR，然后进行测序，表明所有八个菌落都将质粒整合在IS26的PCT结构内。整合的质粒在不同位置被中断并以不同方向插入，表明IS26在靶位点选择上具有随机模式。

为了评估W068_IS26_S对应激的反应，进行了不添加额外DNA的电穿孔处理。在37°C摇动孵育一小时以促进恢复和生长后，将处理过的细胞和等量的未处理W068_IS26_S细胞铺在含有亚碲酸钾的琼脂平板上。过夜培养后，只有经过电穿孔处理的样品显示出菌落生长。通过PCR和测序进行的遗传分析证实，大约三分之一的亚碲酸钾抗性菌落（23个中的7个）显示出pitA因IS26转座子插入而中断。

讨论

等位基因交换诱变是一种有效的细菌基因组编辑方法。这种方法在敏感的鲍曼不动杆菌临床菌株中特别有效。然而，当应用于MDR IC2临床菌株HN85时，电穿孔自杀质粒 consistently resulted in their integration into adjacent regions of IS26 rather than insertion at target sites through homologous recombination。这排除了通过后续重组事件删除靶基因的可能性。质粒的招募是由IS26固有的专门共整合移动机制促成的。IS26的复制转座被动员，允许靶向并最终将自杀质粒整合到染色体中。这种整合过程可以独立于同源重组发生，从而能够在不需要同源性的情况下捕获外源DNA。此外，当对质粒共整合体应用反选择时，IS26表现出显著的“清理”能力，通过删除或中断有害的sacB同时保留有益的telR盒。因此，IS26不仅充当DNA捕获器，还充当“修复器”。

在HN85中观察到的IS26高活性可能归因于其高拷贝数。将单个IS26拷贝引入敏感菌株W068后，质粒整合也受到影响。电穿孔介导的自杀质粒转移不再仅仅导致靶区域的整合。由Tnp26催化的招募发生的频率与同源重组相关的频率相当，与Harmer和Hall的发现一致。因此，我们推测，当暴露于外源双链DNA（dsDNA）（例如外膜囊泡运输的DNA）时，IS26至少使其宿主菌的成功转化概率增加一倍。在含有多个IS26 PCT结构的菌株（如HN85）中，TU切除随后发生复制转座的频率可能高于W068_IS26_S。这种增强的频率将显著提高它们获得外源基因的能力，导致HN85中电穿孔质粒被IS26 consistently recruited。

在HN85的情况下，电穿孔后，更多的细胞选择动员其自身的遗传元件，例如pitA的插入失活，而不是在受到亚碲酸钾选择压力时整合自杀质粒。报告表明，亚碲酸钾主要通过PitA磷酸盐转运蛋白进入大肠杆菌。亚碲酸钾只有在进入细胞后才发挥毒性作用；因此，pitA的失活可以显著降低细胞内亚碲酸钾浓度，导致高亚碲酸钾耐受性。这种机制应该比整合一个自杀质粒并表达其选择标记以减轻亚碲酸钾毒性更有效，后者需要更多的代谢投入。这可以解释为什么在使用亚碲酸钾平板筛选HN85的质粒整合变体时频繁出现假阳性菌落。尽管在W068_IS26_S中也观察到了pitA的插入失活，但它仅在电穿孔后发生。目前对IS26转座的调控了解有限。我们假设电穿孔可能诱导SOS反应，随后通过未知机制刺激IS26转座。

HN85和W068表现出不同的IS谱。在HN85中，两个主要元件ISAba1和IS26占总IS拷贝的79.4%，并且都有助于其MDR表型。作为DNA捕获器，IS26已经 incorporated 了氨基糖苷类抗性基因armA。ISAba1插入ampC上游以及两个bla_OXA-23拷贝，提供了一个强大的启动子，分别赋予对头孢菌素和碳青霉烯类的临床耐药性。相比之下，W068的基因组主要包含来自IS5家族的不动杆菌属特异性IS元件，这些元件在HN85中不存在。W068中最普遍的两个IS元件——ISAba13和ISAba26（分别有33和14个拷贝）——被报道对相邻基因表达没有影响。在W068中观察到的广泛IS插入积累并非敏感鲍曼不动杆菌菌株独有的属性；例如，ATCC17978和ATCC19606拥有少于10个完整的IS插入。尽管这些插入在W068中没有赋予耐药优势，但它们可能促进基因组重塑，有助于适应环境压力。幸运的是，在我们之前的研究中，W068中的IS元件都没有干扰质粒转化。

尽管遗传背景不同，但与其它IS元件相比，IS26在HN85和W068_IS26_S中 consistently mobilized preferentially。这种强大的转座活性可以解释IS26在革兰氏阴性菌中的广泛分布。总之，IS26在鲍曼不动杆菌菌株中的作用可以比作保安：它迅速应对攻击或应激源，有效中和威胁（通过插入或删除有害基因），并迅速获取资源（如外源dsDNA）以确保生存。鲍曼不动杆菌中最普遍和耐药的克隆谱系与最广泛传播的携带IS26的克隆相对应，突显了其对IC2进化和成功的重大贡献。很可能，涉及IS26的获取事件发生在IC2进化历史的早期。随后，IS26强大的招募和转座能力在多重耐药性的