优化单核细胞衍生免疫细胞培养体系：无血清（xeno-free）与异种血清（xeno）条件的表型比较与标准化研究

本研究首次通过光谱流式细胞术系统比较了无血清人AB血清与异种胎牛血清（FBS）培养条件下单核细胞衍生巨噬细胞（Mo-M?）和树突状细胞（Mo-DC）的表型差异，揭示了血清类型对CD1a、CD16、CD163等关键标志物的表达调控，为免疫细胞研究的标准化和临床转化提供了关键实验依据。

　　

引言

免疫系统由提供快速非特异性反应的先天免疫和执行特异性反应的适应性免疫组成。单核细胞体外分化为树突状细胞（Mo-DC）或巨噬细胞（Mo-M?）通常需添加动物血清如胎牛血清（FBS），但其异种蛋白可能激活免疫细胞导致实验结果变异。因此，优化无血清培养条件对确保结果可靠性至关重要。树突状细胞（DC）是最有效的抗原呈递细胞（APC），但其在血液中含量低且缺乏特异性标记物，使得研究中常以单核细胞为前体。单核细胞表面标记物CD14和CD16可用于分选和表型鉴定，其分为经典CD14⁺CD16^–、中间CD14⁺CD16⁺和非经典CD14^–CD16⁺亚群。CD14和CD1分子（包括CD1a、CD1b、CD1c等）是表征单核细胞向DC分化的关键标志，分化过程中CD1分子上调而CD14下调。Mo-DC的其他特征包括高表达MHC-I、MHC-II、CD11b、CD11c，低或不表达FcgRI（CD64）和FCgRIII（CD16）。未成熟DC具有高吞噬潜力和低T细胞刺激能力，其成熟伴随吞噬能力下降和刺激分子（MHC-II、CD80、CD83、CD86、CD40）表达上调。单核细胞和DC的许多表型标记物也可用于鉴定巨噬细胞（Mo-M?），其中经典激活巨噬细胞（M1）上调MHC-II、CD80和CD86，非经典激活巨噬细胞（M2）表达CD163和CD206。目前大多数研究关注细胞因子对巨噬细胞分化的影响，且多依赖FBS培养，缺乏无血清条件的系统比较。

方法

研究从健康捐献者（N=3）获取外周血单核细胞（PBMC），通过Ficoll密度梯度和磁珠分选（MACS）分离经典CD14⁺CD16^–单核细胞，分别用含5%人AB血清或10%热灭活FBS的RPMI培养基培养。Mo-DC分化添加50 ng/mL GM-CSF和20 ng/mL IL-4，未激活巨噬细胞（M0）培养使用20 ng/mL GM-CSF。第6天，Mo-DC用100 ng/mL LPS激活，M0则用LPS或IL-4分别诱导M1或M2表型。第7天收集细胞，通过光谱流式细胞术（Sony ID7000?）分析表型，抗体 panel 包含CD14、CD16、CD1a、CD209、CD80、CD83、CD86、CD40、CD163、CD206等。数据经去卷积和自发荧光校正，统计采用双因素方差分析。

结果

巨噬细胞自发荧光对解混的影响

髓系细胞（尤其巨噬细胞）在培养7天后表现出强自发荧光，光谱范围在400–500 nm（紫外、紫光和蓝绿激光激发），强度可达10³以上。eFluor506与自发荧光光谱重叠严重导致假阴性，改用FITC后解混效果改善。

不同血清对Mo-DC和Mo-M?谱系标记的影响

两种培养条件下均成功实现细胞分化：Mo-M?表达CD14、CD68、CD11c和HLA-DR，Mo-DC表达CD11c、HLA-DR且CD14下调。CD16在FBS培养细胞中表达显著上调（p<0.05）。CD209在Mo-DC中表达超过90%，且FBS条件下平均荧光强度（MFI）更高。CD1a表达在FBS条件下显著上调（Mo-DC和Mo-DC+LPS的MFI差异p<0.0001和p<0.001），而在AB血清中表达低下。uMap可视化显示CD1a、CD16和CD209在FBS培养的M0和Mo-DC中聚集性表达。

不同血清对Mo-DC成熟和Mo-M?激活标记的影响

LPS刺激的Mo-DC中CD80、CD83和CD86表达增加，但CD86在AB血清中表达更高（p<0.05）。Mo-M?中CD83、CD86和CD40表达较高（>50%），CD80在FBS培养的M1中较M0显著上调（p<0.05）。uMap显示共刺激分子在FBS条件下表达更活跃。

不同血清对Mo-M?极化标记的影响

M2标记CD163和CD206在所有Mo-M?中均有表达，但仅CD163的MFI在FBS培养的M1中显著增加（p<0.05）。CD83的MFI在AB血清的M1中较M0更高（p<0.05）。CD86在M1和M2中较M0有上调趋势但未达显著性。uMap显示M1和M2在两种血清中标记物分布差异。

讨论

研究表明异种血清可能激活先天免疫细胞，导致常用表面标记物在无血清条件下效用受限。细胞自发荧光（尤其在紫外-蓝绿光谱区）干扰流式检测，需谨慎选择荧光染料。CD80在FBS培养的M1巨噬细胞中表达更高，提示FBS或促进促炎表型，影响实验设计和治疗策略。CD163和CD206未能可靠区分M2巨噬细胞，因经典单核细胞本身高表达CD163，且MFI比表达百分比更能敏感反映变化。细胞因子组合（如IL-10而非IL-4）可影响CD163表达，延伸培养可能促使细胞获得组织样表型。Mo-DC分化成功由CD209高表达指示，但GM-CSF和IL-4也诱导巨噬细胞表达CD209，提示其非DC特异性标记且涉及免疫激活调节。CD206在GM-CSF培养的巨噬细胞中高表达，但其作为M2标记的可靠性存疑。CD1a表达与FBS条件强相关，在AB血清中低下，提示其不宜作为无血清培养中Mo-DC分化的标志，且可能误导脂质抗原呈递和T细胞反应研究。研究采用原代细胞和光谱流式技术，支持多标记共表达分析，但存在 donor 变异性，需结合功能实验和转录组验证。结论强调血清选择须匹配实验目标和分析方法，推动免疫细胞研究标准化和精准医疗应用。

研究局限包括仅聚焦表面标记、未检测分泌蛋白或转录变化、极化协议单一（LPS for M1, IL-4 for M2），且限于体外系统。未来需结合3D模型和功能共培养，深化标记物生物学功能理解。