水稻远端顺式调控元件（CRE）精细调控Wx基因表达及直链淀粉含量的机制与育种应用研究

本研究通过整合ATAC-seq与生物信息学分析，鉴定并验证了一个调控水稻Wx基因的远端顺式调控元件（CRE）。利用CRISPR/Cas9技术构建cre突变体，发现其在Wxb背景下可显著降低直链淀粉含量（AC）及糊化温度，且不影响农艺性状。该研究为水稻食味品质精准改良提供了新靶点与育种策略。

　　

1 引言

基因表达在真核生物中受多层级调控。转录调控作为直接决定基因表达模式与水平的核心生物学过程，深刻影响植物表型、胁迫耐受性与生产力。顺式调控元件（CRE）作为转录因子识别的短DNA序列 motif，位于基因近端基因组区域，其变异在精细调控基因表达中起关键作用。利用CRISPR/Cas系统靶向基因编码区与CRE区已成为调控靶基因表达、改良植物性状的有效手段。

水稻作为全球最重要粮食作物之一，其稻米品质尤其是蒸煮、食味和外观品质的改良是育种重要目标。稻米中淀粉含量超80%，其中直链淀粉含量（AC）是决定稻米蒸煮食味品质的关键成分，由Waxy（Wx）基因编码的颗粒结合淀粉合成酶（GBSSI）控制。水稻中已发现至少9个自然Wx等位基因，导致AC与稻米品质差异。针对CRE的基因编辑相较于寻找自然或突变等位基因，能更精准调控Wx基因表达与AC。既往研究多聚焦于Wx基因上游2 kb内启动子区及第一内含子区，对远端CRE（>2 kb）的关注较少。

2 方法

2.1 植物材料、载体构建与转化

以携带Wx^b等位基因的粳稻品种日本晴（Nipponbare, NIP）为野生型（WT），并通过传统杂交与连续回交获得携带Wx^a等位基因的近等基因系NIP-Wx^a。根据CRE序列信息手动设计gRNA靶点，经BLAST验证特异性后，通过Golden Gate组装将sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9载体。利用农杆菌介导的成熟胚愈伤组织转化法获得转基因植株，并通过PCR与Sanger测序筛选纯合突变体。

2.2 烟草瞬时表达验证

将野生型CRE片段（WT）与缺失CRE序列的突变型片段（cre）分别克隆至pGreenII0800-LUC载体中Mini35S启动子驱动的LUC报告基因上游，通过农杆菌浸润烟草叶片进行瞬时表达，48小时后检测LUC/REN荧光强度。

2.3 分子生物学分析

提取幼穗总RNA进行RT-PCR与qRT-PCR，以Actin为内参检测Wx基因及25个淀粉合成相关基因表达。使用特异性引物区分前体mRNA（3.3 kb）与成熟mRNA（2.3 kb）。提取成熟种子总蛋白，通过SDS-PAGE与考马斯亮蓝染色分析GBSSI蛋白水平。

2.4 农艺性状与品质分析

调查株高、穗长、每穗粒数、有效分蘖数、结实率等农艺性状，测定千粒重。稻米经干燥后测定表观AC、总淀粉含量、快速粘度分析（RVA）谱及差示扫描量热（DSC）糊化特性。

3 结果与讨论

3.1 远端CRE的鉴定与突变体开发

通过整合水稻花后10天籽粒ATAC-seq数据及叶片与愈伤组织DNase-seq数据，鉴定出一个位于Wx基因上游>2 kb的远端CRE（5′-GCCCACGTGGGC-3′）。瞬时表达验证显示该CRE可增强LUC活性。序列分析发现其包含G-box（CACGTG）、ABRE2（CCACGTGG）、ABRE（ACGTG）及未命名motif（CGTGG），可能被bZIP或bHLH转录因子识别。

利用CRISPR/Cas9在NIP-Wx^b与NIP-Wx^a背景中构建纯合突变体，测序证实存在3–8 bp缺失。在Wx^b背景下，突变体成熟mRNA与蛋白水平显著降低，且成熟mRNA占总mRNA比例下降；而在Wx^a背景下无显著变化。表明该CRE通过影响转录剪接效率调控Wx基因表达，且效应依赖于等位基因背景。

3.2 籽粒理化特性分析

Wx^b-cre突变体AC降低21.43%–31.51%，总淀粉含量无变化。稻粒形态、垩白率与垩白度与WT无差异。RVA分析显示突变体最终粘度降低，DSC证实糊化温度下降，表明稻米质地更软。而Wx^a-cre突变体AC与理化特性无显著变化。

3.3 农艺性状评估

突变体与WT在株高、穗长、分蘖数、穗粒数、结实率及千粒重等农艺性状上无显著差异，表明CRE编辑可精准调控AC而不影响产量性状。

3.4 淀粉代谢的转录重编程

在Wx^b-cre突变体中，AGPase基因（OsAGPS2b、OsAGPL2）表达显著上调，可能源于ADP-葡萄糖积累的反饋调控。淀粉合成酶基因中OsSSI、OsSSIIIa下调而OsSSIIa、OsSSIIb上调；分支酶基因SBEI轻微上调；去分支酶基因OsISA1、OsISA3显著上调。表明淀粉代谢网络存在协同调控，可能受共同转录因子或复合物调控。

4 总结

本研究鉴定了一个远端CRE可精细调控Wx基因表达与AC，且效应依赖于Wx等位基因类型（Wx^b或Wx^a）。在Wx^b背景下，CRE编辑显著降低AC与糊化温度，改善食味品质，且不影响农艺性状。该策略为水稻品质育种提供了新靶点与精准育种方案。