苹果酸-天冬氨酸穿梭在TNF诱导SIRS代谢重编程中的核心作用及机制研究

本期推荐：本研究揭示肿瘤坏死因子（TNF）通过抑制肝核因子HNF4α功能，下调苹果酸-天冬氨酸穿梭（MAS）关键组分citrin（SLC25A13），导致NAD+/NADH失衡，引发脂肪酸β氧化障碍、糖酵解亢进及乳酸清除受损，最终驱动代谢崩溃和血管渗漏——为TNF诱导全身炎症反应综合征（SIRS）的致死机制提供了全新代谢视角。

　　

TNF诱导的SIRS以显著代谢重编程为特征

通过小鼠肝脏RNA测序分析发现，致死剂量TNF处理后18小时，共有1502个基因上调和1310个基因下调。下调基因富集分析显示代谢通路显著受损，尤其是脂质代谢相关通路。实验证实TNF处理导致血浆游离脂肪酸（FFA）和甘油水平升高，但白色脂肪组织重量未显著减少，提示脂肪酸氧化障碍而非脂解增强是主要因素。线粒体脂肪酸β氧化能力检测显示，TNF处理后棕榈酰肉碱驱动的氧消耗率（OCR）显著降低。同时，单羧酸代谢过程（包括丙酮酸和乳酸代谢）亦受干扰，TCA循环相关基因表达下调，丙酮酸驱动的线粒体呼吸减弱，而糖酵解基因表达上调，伴随严重高乳酸血症、低血糖和肝糖原耗竭。乳酸介导的糖异生（GNEO）关键酶（Ldhb、Pck1、G6Pc）表达下调，表明乳酸清除能力受损。

TNF损害苹果酸-天冬氨酸穿梭导致NAD⁺与NADH缺乏

下调基因富集分析提示瓜氨酸血症（citrullinemia）通路显著富集，该病与SLC25A13（citrin）突变导致的MAS功能障碍相关。MAS由四种酶（MDH1、MDH2、GOT1、GOT2）和两种线粒体载体（OGC/SLC25A11、AGC/SLC25A13/citrin）组成，负责胞质NAD⁺再生和线粒体NADH生成。TNF处理后MAS基因普遍下调，其中Slc25a13表达下降最显著，且SLC25A13和SLC25A11蛋白水平降低。肝脏NAD⁺和NADH水平显著下降，反映胞质NAD⁺和线粒体NADH短缺。机制上，下调基因与HNF4α功能丧失（LOF）高度相关，启动子 motif 分析显示HNF4α结合位点富集。肝细胞特异性Hnf4α敲除小鼠对TNF敏感性增强，且Slc25a13启动子存在HNF4α结合位点，证实TNF通过抑制HNF4α转录活性下调Slc25a13表达。

Citrin敲除导致TNF诱导SIRS的急性致死与代谢紊乱加剧

Slc25a13^-/-小鼠对亚致死剂量TNF表现为急性死亡，并出现更严重的低体温和高乳酸血症。TNF处理后8小时，Slc25a13^-/-小鼠肝脏NAD⁺和NADH水平较野生型进一步下降。转录组分析显示，TNF处理后Slc25a13^-/-小鼠差异表达基因数量显著增加（上调1942个、下调2227个），且下调基因富集于脂质代谢通路。表型上，Slc25a13^-/-小鼠血浆FFA和甘油水平升高更早，但脂肪组织重量和脂解基因Lipe表达未增加，提示脂肪酸氧化障碍是主因。线粒体脂肪酸β氧化能力检测显示，Slc25a13^-/-小鼠基线OCR已降低，TNF处理后进一步恶化。肝组织脂滴积累在基础状态下即增多，TNF处理后加剧，表明citrin缺失通过损害β氧化导致脂质积聚。

Citrin敲除加剧有氧糖酵解和乳酸清除障碍

Slc25a13^-/-小鼠TNF处理后糖酵解基因上调更显著，低血糖和高乳酸血症更严重，肝糖原耗竭加速。葡萄糖耐受试验显示Slc25a13^-/-小鼠葡萄糖利用加快，乳酸生成增加；丙酮酸驱动的线粒体OCR进一步下降。乳酸耐受试验表明Slc25a13^-/-小鼠乳酸清除能力受损。机制上，MAS功能障碍导致胞质NAD⁺短缺，迫使细胞依赖LDHA介导的乳酸生成维持糖酵解，同时线粒体NADH不足抑制丙酮酸氧化。高乳酸血症驱动VEGF表达升高和血管通透性增加，Slc25a13^-/-小鼠对乳酸注射的致死敏感性增强。

讨论

TNF诱导SIRS的代谢紊乱（Warburg样表型、脂肪酸氧化抑制）可能与NF-κB/HIF1α、ROS或PPARα/PGC1a通路相关，但MAS功能障碍提供了统一机制。TNF通过HNF4α LOF下调Slc25a13，破坏NAD⁺/NADH稳态。NAD⁺短缺可能抑制SIRT1-PGC1a-PPARα轴，导致脂质代谢基因转录抑制。糖代谢方面，MAS缺陷时甘油-3-磷酸穿梭和LDHA代偿激活，但TNF驱动的强糖酵解仍导致乳酸过度堆积。乳酸清除障碍源于NAD⁺依赖的LDHB活性受限。高乳酸通过VEGF诱导血管渗漏促进死亡，提示补充NAD⁺前体（如烟酰胺核糖）可能具有治疗潜力。

材料与方法

研究使用C57BL6/J、Hnf4a^fl/fl（肝细胞特异性敲除）、Slc25a13^-/-（Crispr/Cas9构建）小鼠。TNF腹腔注射，剂量依实验设计（25–35 μg）。监测体温、生存率，采集血液和组织样本。检测指标包括血浆FFA、甘油、乳酸、葡萄糖、VEGF（ELISA）、肝糖原、NAD⁺/NADH（比色法）、线粒体OCR（Seahorse）、肝脂滴（LipidTOX染色）、血管通透性（FITC-葡聚糖渗出）。转录组分析采用RNA-seq（DESeq2差异表达、Enrichr/Metascape/HOMER富集分析），Western blot检测SLC25A13/SLC25A11蛋白。统计采用t检验、ANOVA、Log-Rank检验。