低氧制造条件下功能性CD19 CAR T细胞的生产及其在慢性淋巴细胞白血病治疗中的潜力

本研究探讨在2% O2低氧条件下生产CD19 CAR T细胞（HypCAR）对细胞表型、功能及代谢特性的影响，发现低氧制造可促进 na?ve 样细胞富集、增强线粒体活性，并维持细胞毒性功能，为改善CAR T细胞在低氧肿瘤微环境（TME）中的疗效提供了新策略。

　　

Introduction

慢性淋巴细胞白血病（Chronic lymphocytic leukemia, CLL）是一种难以通过嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR）T细胞疗法治愈的血液恶性肿瘤。CLL细胞可负向调控T细胞适应性并诱导伪低氧状态。本研究假设在类似于组织生理氧水平（即2% O₂）的受限氧条件下制造CAR T细胞，可促进低氧耐受性CAR T细胞的生长。

Materials and methods

研究使用健康供者（Healthy donors, HDs）和CLL患者的外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），通过γ-逆转录病毒载体编码的抗CD19 CAR（含CD28共刺激域）生产CAR T细胞。细胞在2% O₂（^HypCAR）或21% O₂（^NorCAR）条件下培养，使用AIM-V培养基并添加IL-2和血清。表型和功能分析通过流式细胞术（CytoFLEX和FACS Canto）进行，细胞毒性通过荧光素酶法和铬-51释放法评估。

Results

^HypCAR T细胞富集na?ve样T细胞

在2% O₂条件下生产的HD来源CAR T细胞（^HypCAR）显示出na?ve样（T_N）细胞亚群的富集。与^NorCAR相比，^HypCAR细胞在表型和功能上存在差异：CD4+ ^HypCAR细胞产生更多IL-2和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF）。低氧生产不影响细胞存活或抗原刺激后的增殖，反而增加激活水平。在低氧慢性刺激后，^HypCAR细胞仍富集na?ve样细胞，并保持细胞毒性和细胞因子产生能力。CLL患者来源的CAR T细胞在功能和表型上与健康供者类似，但线粒体代谢存在差异。

^HypCAR和^NorCAR产品功能差异

抗原刺激后，^HypCAR和^NorCAR在脱颗粒（CD107a表达）和IFN-γ产生频率上相似，但CD4+ ^HypCAR在低氧条件下（Hyp-Hyp）产生更多IL-2和TNF。在1:2效应靶比（E:T ratio）下，^NorCAR细胞毒性高于^HypCAR，但在更高E:T比例下无差异。

低氧生产不影响存活、增殖或激活，并促进反复抗原刺激后的na?ve样表型

反复刺激后，^HypCAR细胞在T_N和中央记忆（T_CM）细胞上富集，而^NorCAR以效应记忆（T_EM）为主。低氧条件下生产的细胞在反复刺激后仍保持较高的na?ve样比例和激活标记（如CD69）表达。

低氧条件下慢性刺激后^HypCAR和^NorCAR效应功能及免疫检查点表达相似

反复抗原刺激后，两种CAR T细胞在免疫检查点（PD1、TIM3、LAG3）表达、细胞因子产生（IFN-γ、IL-2、TNF）和细胞毒性上无显著差异。但^NorCAR在某些时间点产生更多细胞因子。

抗原特异性刺激后^HypCAR和^NorCAR产品的代谢特征不同

^HypCAR细胞显示较高的线粒体极化（TMRE^hi）和活性氧（MitoSOX^hi）频率，CD8+ ^HypCAR在反复刺激后表达更多氨基酸转运蛋白CD98，提示其可能具有营养匮乏环境下的生存优势。

CLL来源^HypCAR T细胞线粒体质量、电位和mROS增加

CLL患者来源的CAR T细胞在低氧生产后显示较高CD4/CD8比例，线粒体质量（MitoTracker Green）、膜电位（TMRE）和线粒体活性氧（mROS）增加，但表型、细胞因子产生和细胞毒性与常氧产品相似。

Discussion

本研究证明，在2% O₂低氧条件下生产CD19 CAR T细胞可行，且能诱导持久的功能和表型变化。低氧制造促进na?ve样细胞富集，增强线粒体活性，并维持效应功能，这可能有助于CAR T细胞在低氧肿瘤微环境中的持久性和疗效。CLL来源CAR T细胞显示线粒体功能增强，这与临床反应相关的特征一致。低氧制造是一种简单易行的策略，可优化CAR T细胞产品，但需进一步体内研究验证其抗肿瘤效果。