基于荧光微球多重检测技术的大布鲁氏菌（Brucella canis）血清抗体定量诊断新方法的建立与评价

本刊推荐：本研究成功开发了一种基于荧光微球的多重检测技术（CBM），可同步检测犬血清中布鲁氏菌（B. canis）BP26与Omp31肽段（PO1）抗体。该技术突破传统2ME-RSAT/AGID II检测对生物安全三级实验室（BSL3）的依赖，实现定量、自动化分析，经贝叶斯潜类别模型（BLCM）验证显示灵敏度达91.6%、特异性94.9%，为犬布鲁氏菌病的精准诊断与流行病学监测提供重要技术支撑。

　　

引言

犬布鲁氏菌（Brucella canis）是一种革兰阴性蛋白细菌，属于布鲁氏菌科，可导致犬类布鲁氏菌病。该病原体自1968年被发现以来，已知具有人畜共患潜力。犬感染后的临床表现通常非特异性，包括淋巴结炎、椎间盘炎和睾丸炎/附睾炎等，雌性犬常在妊娠30至57天发生自发性流产。据估计，美国犬群中该菌流行率约为5%，且已在全球多国被发现。疫情暴发可能影响人类健康并对犬繁殖业造成重大经济损失。

确认犬布鲁氏菌感染的金标准是从血液或组织中培养细菌，但由于菌血症可能间歇性发生，培养敏感性低且假阴性结果常见。此外，该菌培养困难，生长缓慢。因此，血清学检测被开发用于诊断。传统方法包括快速平板凝集试验（RSAT）、试管凝集试验（TAT）、琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、免疫荧光抗体试验（IFA）和多种酶联免疫吸附试验（ELISA）。但这些检测可能存在与其他革兰阴性细菌（如铜绿假单胞菌、支气管炎博德特菌和耶尔森菌属）的交叉反应，导致假阳性。因此，筛查试验后需用参考试验确认。常用参考试验组合是2-巯基乙醇快速平板凝集试验（2ME-RSAT）和采用犬布鲁氏菌胞质成分的琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID II）。该组合特异性极高（AGID II特异性估计>99%），但生产面临挑战：需在生物安全三级（BSL3）条件下定期培养病原体，且需大量特征明确的阳性对照犬血清（最好来自实验感染的无特定病原体犬），此外结果判读不能自动化，存在主观性。

本研究旨在开发一种新型血清学检测方法，以克服当前犬布鲁氏菌诊断参考试验的挑战。该方法采用重组抗原，以多重检测形式生产，无需人类实验室暴露风险或大量阳性对照犬血清，可产生客观、定量结果，并为犬布鲁氏菌感染的血清学诊断提供合理的敏感性和特异性。

材料与方法

血清样本

所有犬血清样本由兽医从业者提交至康奈尔大学动物健康诊断中心（AHDC）进行犬布鲁氏菌血清学检测。样本均通过2ME-RSAT和AGID II试验进行测试。2ME-RSAT使用热灭活的全细胞犬布鲁氏菌（M-）抗原，AGID II使用犬布鲁氏菌（M-）胞质抗原。

共检测了2020年8月至2022年8月间提交的1582份诊断血清样本，并将其分为两个群体进行统计分析。为进一步评估敏感性，还评估了42份存档血清样本，这些样本来自犬布鲁氏菌血培养阳性的病例。

回顾性评估了2023年1月至2024年12月期间提交的血清样本数据，以了解实际使用中的检测性能。

2ME-RSAT和AGID II试验

两种试验的抗原均在BSL3条件下于布鲁氏菌琼脂上培养犬布鲁氏菌（M-）菌株生产。收集的细菌用PBS洗涤，80°C热灭活至少20分钟。确认无活性后，移至实验室进行进一步处理。用于平板凝集的抗原用PBS洗涤，用玫瑰红溶液染色过夜，重新悬浮于 tris-马来酸盐缓冲液中，并稀释至6%浓度。产品与当前抗原批次进行比较测试后分装储存。用于AGID II试验的细菌悬液通过French Press处理，裂解物以8000 × g离心，上清液再以63000 × g超速离心澄清。所得上清液经过测试并稀释，以匹配当前使用的胞质抗原结果。

所有诊断样本均通过2ME-RSAT和AGID II测试进行检测，结果判读基于两种测试结果的评估以及动物的相关测试/健康史（如果提供），遵循既定标准操作程序。

通过蛋白质印迹和蛋白质组学分析鉴定犬布鲁氏菌免疫反应性抗原

犬布鲁氏菌抗原制备如2ME-RSAT所述，用含1% 2-ME的Laemmli样品缓冲液1:2稀释，煮沸3分钟，在12% SDS-PAGE凝胶上解析，并转移至PVDF膜进行后续免疫印迹。使用先前通过犬布鲁氏菌参考试验（2ME-RSAT和AGID II）呈阳性或阴性的犬血清探测免疫印迹。血清稀释度为1:400，血清抗体结合用HRP标记的兔抗犬IgG（H + L）检测，稀释度为1:20000，用ECL蛋白质印迹底物解析。在免疫印迹上发现了一个表观分子量约为28 kDa的显著条带（数据未显示）。该条带从并行运行的考马斯亮蓝染色凝胶中提取，并送交康奈尔大学生物技术资源中心进行质谱分析。与蛋白质数据库比较显示，主要蛋白质是流产布鲁氏菌BP26蛋白的同源物。

犬布鲁氏菌BP26抗原的克隆、表达和纯化

从AHDC保存的犬布鲁氏菌（M-）菌株分离的基因组DNA中克隆了全长BP26。用于生产此处描述的BP26抗原的引物列于表中。将全长BP26（753 bp，GenBank，AQNA01000002）克隆到经NcoI和BamHI消化的pQE-60载体中，与C端6×组氨酸标签框内连接。通过将截短构建体亚克隆到经NcoI/BamHI消化的pQE-60载体中，去除21个氨基酸的N端跨膜结构域，产生了溶解度更高的BP26抗原版本，从而改善了蛋白质表达。

BP26蛋白在SG13009大肠杆菌表达宿主中表达，该宿主在含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB肉汤中生长。通过添加1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达。将细菌悬浮于尿素裂解缓冲液（100 mM磷酸钠，10 mM Tris，8 M尿素，pH 8.0）中并进行超声处理。裂解液通过离心澄清，与40 mM咪唑缓冲液（40 mM咪唑，20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl）以1:5混合，并通过0.22 μm Steritop过滤器过滤灭菌。使用FPLC仪器在HisTrapFF Ni-NTA柱上纯化组氨酸标签蛋白，并用500 mM咪唑缓冲液（500 mM咪唑，20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl）洗脱。洗脱的蛋白质组分对磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）进行透析。通过BCA测定法测定蛋白质浓度。

Omp31免疫反应性区域的鉴定和生产

通过搜索蛋白质数据库鉴定犬布鲁氏菌免疫反应性蛋白质，从而确定了其他候选抗原。其中一个研究的候选者是Omp31（ERU01676.1）。如BP26所述克隆了全长蛋白质；然而，该重组蛋白对上述BP26生产平台中的大肠杆菌具有毒性，且重组蛋白的纯度难以确定（数据未显示）。这促使我们开始研究Omp31的潜在免疫反应性肽段，从评估潜在的外膜环开始。

进行了Omp31的跨膜拓扑预测。首先，根据SignalP-4.1预测去除了信号序列。随后，用TMpred评估了序列。基于平均埋藏倾向的分析，假设蛋白质C端结构域的一个区域（代表Omp31蛋白第49-77位氨基酸）是一个外部暴露的环，可能增加免疫识别的暴露程度。合成了源自该区域的肽段（PO1, [NH2]GKFKHPFSSFDKEDNEQ[COOH]），并通过添加到肽段C端的半胱氨酸氨基酸与马来酰亚胺活化的牛血清白蛋白（BSA）偶联，遵循制造商说明。

抗原与荧光微球的偶联

为准备多重检测，将BP26偶联到荧光微球33上，将BSA偶联的PO1偶联到荧光微球34上，对于三抗原检测的对照，将AGID II试验生产的胞质抗原（CytAg）偶联到荧光微球35上（Luminex Corp.）。偶联按照制造商建议使用既定实验室方案进行，如前所述。简言之，所有步骤在室温下进行，通过涡旋和超声处理悬浮微球，在黑暗中进行孵育，并通过以4700 × g离心4分钟使微球沉淀。将微球储备液（1.0 × 10⁷ 微球）用无菌超纯水洗涤。首先将微球悬浮于100 mM磷酸钠pH 6.2中以进行活化。接着，加入20 μL 10% (w/v) Sulfo-N-羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS），随后加入20 μL 10% (w/v) 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），孵育20分钟。然后用50 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液pH 5.0（MES）洗涤微球两次。将活化的微球与MES缓冲液以及200 μg的BP26、BSA偶联的PO1蛋白或CytAg在1 mL体积中混合，并旋转3小时以完成偶联。接着，将微球在PBN封闭缓冲液（PBN，含0.1%牛血清白蛋白和0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水）中孵育30分钟，最后用含0.02% (v/v) Tween 20的PBN封闭缓冲液洗涤三次。计数微球并在2–8°C避光储存。每个偶联批次均进行单重检测，并与之前的偶联批次进行比较，使用先前测试的阴性、弱阳性和强阳性血清确保各批次结果可比。

用于定量犬血清中布鲁氏菌特异性抗体的多重检测

将偶联了BP26和PO1的微球33和34（用于双抗原检测），或用于三抗原检测的偶联了对照CytAg的微球35，进行超声处理、混合，并在PBN封闭缓冲液中稀释至最终浓度为10⁵ 微球/mL。将犬血清样本在PBN中以1:600稀释。先前测试的阴性、弱阳性和强阳性犬血清作为阴性和阳性对照设置在每个检测板上。用含0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲盐水（PBST）湿润Millipore Multiscreen HTS板10分钟。使用ELx50板洗板机（Biotek Instruments Inc.）进行此次孵育及后续洗涤步骤的PBST添加和抽吸。抽吸PBST后，将50 μL每种稀释的血清或对照样品添加到板的相应孔中。接着，向每孔加入50 μL微球溶液，将板在室温下摇动孵育30分钟。将血清孵育过的微球洗涤三次后，向每孔加入50 μL以1:3500在PBN中稀释的生物素化兔抗犬IgG（H + L），并如上所述孵育30分钟。经过一个洗涤步骤后，向每孔加入50 μL以1:100在PBN中稀释的链霉亲和素-藻红蛋白（Invitrogen）。将板如上所述孵育30分钟，然后洗涤。将微球重悬于100 μL PBN中，并如上所述孵育15分钟。使用Luminex 200仪器（Luminex Corp.）和BioPlex软件（Bio-Rad Laboratories Inc.）分析重悬的微球。数据报告为中位荧光强度（MFI）。

统计分析

使用贝叶斯潜类别模型（BLCM）评估双抗原（BP26和PO1）犬布鲁氏菌多重（CBM）检测的性能。该模型通过利用两个预期流行率不同的群体来估计CBM检测和参考试验的敏感性和特异性。为使模型可识别，自由度必须大于或等于模型中未知参数的数量。在这种情况下，包含两个不同流行率的群体，并假设检测的敏感性和特异性在群体间恒定，使得模型可识别。这两个群体是：(1) 常规北美诊断提交样本（通常因临床症状与犬布鲁氏菌感染一致或为繁殖前筛查而收到，n = 1192），和 (2) 北美提交样本（要求提供无感染证明用于犬或犬精液从美国出口到外国，n = 390）。后一群体中的犬通常没有与犬布鲁氏菌相关的临床症状。关于参考试验特异性和群体流行率的先验信息使用基于已发表数据和实验室提交历史的单峰β分布进行建模。2ME-RSAT和AGID II组合试验的特异性估计>99%，最小可能值为94%。根据AHDC 2015-2019年犬布鲁氏菌血清学历史诊断提交情况，估计非出口北美诊断样本的阳性结果流行率为10%，最大可能值为20%，出口样本提交的流行率估计为0.01%，最大可能值为1%。这些细节用于使用R（版本4.2.1）中epiR包的epi.betabuster函数推导先验分布的参数。对于待评估检测的敏感性和特异性以及参考试验的敏感性，使用均匀先验分布beta(1,1)。贝叶斯模型在R中使用JAGS通过R2jags包运行，并使用mcmcplots和coda包进行诊断可视化。为研究模型对定义先验的敏感性，还使用信息量最小的先验beta(1,1)评估了模型。

通过评估15组不同BP26和PO1 cut-off值下的BLCM模型输出进行ROC曲线分析。使用梯形法则计算ROC曲线下面积（AUC）。

对于所有统计分析，参考试验中认为“不确定”的样本（n = 43，全部来自北美诊断提交样本）根据具体的2ME-RSAT/AGID II参考试验结果处理为“阳性”或“阴性”：如果2ME-RSAT结果为“阳性”且AGID II结果为“可疑”（n = 16），则不确定样本分类为“阳性”，否则（2ME-RSAT“阴性”/AGID II“可疑”，或2ME-RSAT“阳性”/AGID II“阴性”）视为“阴性”（n = 27）。

结果

两种免疫反应性抗原的联合检测有助于犬布鲁氏菌感染的血清学诊断

由于现有的犬布鲁氏菌感染实验室诊断方法存在显著的实际局限性，我们试图开发并探索一种使用两种来自该人畜共患病原体的免疫原性重组抗原（BP26和PO1）的新型检测方法。每种抗原均在单重检测和组合多重检测形式中与阴性、弱阳性和强阳性血清进行了评估，当微球多重化时未观察到值的显著差异。选择每种抗原的 cut-off 值以优化敏感性和特异性；BP26 < 2400 MFI 且 PO1 < 1000 MFI 的样本视为阴性，高于这些 cut-off 值的样本视为非阴性。

由于诊断犬布鲁氏菌感染的金标准是细菌培养，我们评估了来自42只犬的存档血清样本，这些犬伴有犬布鲁氏菌血培养确认。我们发现其中39份样本在2ME-RSAT/AGID II参考试验中呈阳性，而9份“不确定”（仅在2ME-RSAT上呈阳性反应，在AGID II上呈可疑（6/9）或阴性（3/9）反应）。42份血清样本中的39份在双抗原CBM检测中呈非阴性，其中2只犬仅产生BP26抗体值，9只犬仅产生PO1抗体值，28只犬产生的两种抗原抗体值均高于 cut-off 值。这些结果表明这些确诊感染犬的犬布鲁氏菌抗体反应存在个体差异。大多数犬（n = 22）的PO1抗体值高于BP26，而17只犬显示相反趋势，三只犬未检测到针对任一抗原的抗体。总之，这些结果证明了在CBM检测中包含两种抗原对于识别确诊感染犬的犬布鲁氏菌特异性抗体的价值。

双抗原检测的敏感性和特异性被证明是合理的

鉴于血清学参考试验并非诊断犬布鲁氏菌感染的真正“金标准”，我们采用BLCM分析来估计双抗原CBM检测的准确性。该方法允许估计待评估检测以及参考试验的敏感性和特异性，并估计模型中包含的每个群体的血清流行率。

我们使用关于参考试验特异性和预期群体流行率的先验信息来帮助告知模型（如材料与方法中所述）。先验信息的分布呈现在补充图中。

通过评估15组不同 cut-off 值下的BLCM模型输出来生成ROC曲线。ROC曲线下面积（AUC）为0.913（95% CI, 0.883–0.917），表明参考试验与双抗原CBM检测之间存在极好至出色的的一致性。

在 cut-off 值 BP26 < 2400, PO1 < 1000 下，双抗原CBM检测和参考试验的敏感性和特异性估计值呈现在表中。双抗原CBM检测的敏感性估计为91.6%（95% CI, 85.2–98.0%），显著高于参考试验的估计敏感性66.1%（95% CI, 55.2–81.7%）。双抗原CBM检测的特异性估计为94.9%（95% CI, 92.3–96.9%），略低于参考试验的估计特异性99.8%（95% CI, 99.0–100.0%）。估计出口样本提交的血清流行率为0.1%（95% CI, 0.0–0.6%），常规诊断提交的血清流行率为16.1%（12.6–19.3%）。

为测试BLCM分析的稳健性，评估了使用信息量最小先验（所有变量为beta(1,1)）的模型。信息量最小模型产生了可比的结果，仅估计群体流行率略有增加，估计敏感性相应小幅下降，特异性估计值增加，表明模型结果不受先验信息的强烈影响。

这些结果共同表明，由重组犬布鲁氏菌BP26和PO1抗原组成的新型双抗原CBM检测是用于犬犬布鲁氏菌感染血清学诊断的稳健可靠工具。

包含额外的对照微球可提高检测敏感性

检测敏感性和特异性的相对重要性由多种因素定义，对于伴侣动物中人畜共患病原体的诊断，可能期望最大化敏感性以减少假阴性检测结果；为提高检测敏感性，我们评估了添加一个与粗抗原提取物（CytAg，也用于AGID II试验）结合的对照微球。在纳入检测之前，评估了一组150份具有可测量PO1和/或BP26抗体的存档诊断血清样本在CBM检测中，观察到PO1和BP26定量值的微小变化（%CV < 7）。选择了一个 cut-off 值，其中 CytAg < 1100 MFI 的样本视为阴性，高于此 cut-off 值的样本视为非阴性；检测中任何三个微球呈非阴性结果的样本均视为非阴性。包含该对照微球导致检测到另外两个真实阳性样本，使CBM检测的总体诊断敏感性达到97.6%（41/42）。

虽然添加CytAg对照微球提高了检测的敏感性，但也影响了检测的特异性。从2023年1月到2024年12月，大约10,000份诊断样本在CBM检测上进行了测试，该检测包括两个重组抗原微球和对照微球。总共有1,379份样本产生非阴性结果。所有测试非阴性的样本随后均在参考试验上进行了确认测试。在1,379份非阴性样本中，484份仅在CytAg上呈非阴性。其中只有4.3%（21/484）在参考试验上确认为阳性，4.3%（21/484）在参考试验上产生不确定结果。总体而言，添加CytAg对照微球提高了检测敏感性，但也降低了检测特异性。

讨论

CBM检测是一种新型的基于荧光微球的多重检测，可同时检测针对两种犬布鲁氏菌抗原（BP26和PO1肽段）的抗体，以辅助诊断犬犬布鲁氏菌感染。这两种重组抗原通过简化高效的生产工艺生产，无需BSL3要求。CBM检测产生自动化、定量结果，并为当前犬布鲁氏菌诊断的2ME-RSAT/AGID II参考试验提供了改进的诊断敏感性。

将重组抗原用于诊断血清学检测通常比粗抗原提取物具有更高的特异性，然而，鉴定具有最佳敏感性的抗原可能具有挑战性。通过利用基于微球的多重平台，可以在同一反应中并行评估多种抗原。该平台的优势还包括更低的检测下限、降低的背景反应性和更宽的定量线性范围。此处描述的两种抗原对检测犬犬布鲁氏菌抗体具有特异性，同时检测针对两种抗原的抗体有助于提高CBM检测的敏感性和特异性。包含粗抗原对照CytAg不会影响重组抗原的抗体值，并且有助于提高敏感性。包含这种额外抗原确实会导致特异性降低。

BP26是一种从流产布鲁氏菌S19中分离的26 kDa蛋白质，二十多年前被描述为可能用于诊断除犬布鲁氏菌外多种布鲁氏菌物种布鲁氏菌病的靶点。后来发现，该抗原用于检测布鲁氏菌感染的诊断敏感性有限，并且因感染物种和引起感染的菌株而异。我们此处报告的结果是首次尝试使用BP26诊断犬布鲁氏菌感染。BP26抗原的一个潜在限制是其与SIMPL结构域包含蛋白YggE具有中度同源性，后者存在于土壤杆菌属物种中。该属细菌通常不被认为是致病性的，感染该生物可能导致假阳性犬布鲁氏菌血清学反应。

Omp31蛋白先前已被研究作为布鲁氏菌疫苗的组成部分。PO1肽段源自Omp31蛋白的一个推定外膜环。Omp31及相关PO1肽段对布鲁氏菌物种（包括犬布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌）具有特异性。然而，Omp31在流产布鲁氏菌中缺失。我们研究使用PO1肽段进行布鲁氏菌感染血清学诊断的方法是新颖的，并突出了将PO1和BP26配对用于血清学犬布鲁氏菌诊断的优势。需要进一步研究以确定该肽段是否也能改进其他物种布鲁氏菌感染的血清学诊断检测。

2ME-RSAT/AGID II参考试验被认为具有高敏感性和特异性。然而，与所有血清学检测一样，它并非确认病原体感染的真正“金标准”。更具体地说，犬布鲁氏菌参考试验在感染早期抗体低于检测下限时可能产生假阴性结果。可能需要感染后2到3个月，2ME-RSAT/AGID II才会显示阳性结果。参考试验结果也可能是假阳性，例如，如果在疾病清除后很长时间血清中仍维持抗体。2ME-RSAT的结果在动物无菌血症后约3个月内将保持阳性，而AGID II检测在犬清除感染后最多3年内可能保持阳性。这些用于诊断感染的抗体检测挑战导致血清学检测敏感性和特异性测量的统计不确定性。BLCM分析通过估计参考试验和CBM检测的敏感性和特异性来解释其中一些挑战，如先前对其他血清学检测所示。分析显示，参考试验的敏感性低于预期，为66.0%（95%CI, 55.2–81.7），而新型双抗原CBM检测的敏感性估计为91.6%（95% CI, 85.2–98.0），且95%可信区间无重叠。该估计值与培养阳性犬的结果92.9%（39/42）密切匹配。正如预期，参考试验表现出>99%的特异性；双抗原CBM检测的特异性>92.3%。

在美国，可用于犬布鲁氏菌感染血清学检测的筛查检测数量有限。最近一项研究评估了可用犬布鲁氏菌筛查检测的性能特征，包括侧流层析试纸条、IFA和ELISA，并与CBM、2ME-RSAT和AGIDII进行了比较。该研究揭示，所有评估的筛查检测与参考试验相比具有出色的敏感性，但这些筛查检测的特异性，特别是ELISA和IFA的特异性，支持需要对非阴性结果进行后续评估确认。

通常建议对所有感染犬布鲁氏菌的犬进行绝育/去势或安乐死。当选择治疗而非安乐死时，在治疗期间和治疗后持续监测抗体值可能是合适的。抗菌治疗将减少菌血症，同时抗体随时间推移相应减少，然而停药后菌血症可能反弹。细菌复活可能发生在没有疾病临床症状的犬中，并构成潜在的公共卫生威胁。使用敏感且定量的检测（如CBM检测）进行持续血清学监测，可能有助于为细菌复活提供证据。最近一项评估使用CBM检测监测犬布鲁氏菌感染犬治疗反应的研究揭示，PO1抗体值的下降与临床症状的缓解相关。

本研究的主要限制是在BLCM分析中使用了来自临床状况和历史未知的犬的诊断提交样本。此外，在BLCM分析中包含一个极低流行率群体引入了敏感性测量的较大不确定性，然而，对一组42份来自确认感染犬布鲁氏菌动物的血清样本的评估证实了CBM检测获得的敏感性结果。本研究的其他限制与BLCM分析固有的假设有关，这些包括：(i) 检测的敏感性和特异性在群体间是恒定的，以及 (ii) CBM和参考试验结果在真实疾病状态条件下是独立的。检测敏感性和特异性值可能受群体特征影响，包括感染压力等因素或交叉反应因子的存在。因此，来自外国的提交样本（其感染压力和交叉反应因子的存在可能不同）未包含在BLCM分析中。关于条件依赖性，两种测量抗体反应的检测通常被认为是条件依赖的。然而，此处使用的检测测量了针对不同抗原的抗体。参考试验测量针对胞质抗原（AGID II）和/或细胞表面抗原（2ME-RSAT）的抗体，而CBM检测检测针对周质蛋白（BP26）和外膜蛋白一部分（PO1）的抗体。即便如此，将该模型中的潜类别视为抗体产生而非疾病状态可能是合适的，因为本研究中评估的所有检测都需要抗体产生才能产生阳性结果。此外，如果细菌隐藏在身体某个区域（例如，眼睛、中枢神经系统、睾丸），并且外周免疫系统不再受到刺激，抗体产生可能停止，导致感染动物出现阴性血清学结果。尽管存在这些限制，参考试验与CBM检测的一致性极好，AUC > 0.8 证明了这一点。

总之，CBM检测是一种稳健、可靠且定量的检测方法，用于检测犬血清中的犬布鲁氏菌抗体，并辅助诊断犬布鲁氏菌感染。虽然双抗原CBM检测既敏感又特异，但包含CytAg对照微球进一步增强了检测敏感性。在许多情况下，仍需要通过参考试验测试和/或尝试培养细菌来确认感染，因为不应仅根据任何一种血清学检测的结果做出安乐死决定。鉴定可替代多重检测中CytAg的额外布鲁氏菌特异性重组抗原可以进一步提高CBM检测的准确性。正在进行进一步研究以评估CBM检测用于感染确认、监测治疗反应、检测其他布鲁氏菌物种感染和疾病监测的用途。