RNA测序独立驱动乳腺癌与肺癌新抗原发现及疫苗验证：一项突破性免疫治疗研究

本综述系统阐述了仅基于RNA测序（RNA-seq）的新抗原预测策略在乳腺癌和肺癌免疫治疗中的突破性应用。研究通过建立计算生物学预测流程（NetMHCpan/NetMHC-IIPAN），结合体外T细胞反应验证（ELISpot检测IFN-γ）和体内肿瘤模型疗效评估，证明RNA-seq可同步获取基因突变、HLA分型和表达谱数据，显著降低新抗原筛选成本并扩展非编码区新抗原发现范围，为低肿瘤突变负荷（TMB）肿瘤的个性化疫苗开发提供新范式。

　　

引言

新抗原作为肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点，其传统鉴定方法依赖全外显子测序（WES）与RNA测序的联合策略，存在成本高、周期长和技术局限性等问题。本研究创新性地提出仅通过RNA测序即可完成新抗原预测的整合性方案，重点解决传统方法对非编码区突变、低频率亚克隆突变（VAF < 5-10%）和肿瘤异质性表征不足的缺陷。研究通过小鼠乳腺癌4T1细胞、肺癌LLC细胞和乳腺癌临床样本的多维度验证，证实RNA测序可同步提供体细胞变异检测、HLA分型（seq2HLA软件）和基因表达定量（TPM/RPKM）三重关键数据。

方法

研究采用Sentieon Genomics分析流程对RNA-seq数据进行质控（fastp v0.16.0）、比对（hisat2/stringtie）和突变调用，设置严格过滤阈值：测序深度（DP≥50×）、等位基因深度（AD≥5×）、链偏倚（SOR≤5.0）和变异等位基因频率（VAF≥5%）。新抗原优先级评分整合MHC结合亲和力差异（ΔIC50）、基因表达水平、突变一致性等多维权重参数。通过NetMHCpan v4.0和NetMHC-IIPAN预测肽段与MHC分子的结合力（IC50<500nM为阳性），并合成27-31aa长度的新抗原肽段（纯度>95%）。免疫原性验证采用自体骨髓来源树突状细胞（BMDCs）与脾细胞/PBMCs共培养体系，通过IFN-γ ELISpot检测T细胞特异性应答。体内疗效评估在BALB/c（4T1模型）和C57BL/6（LLC模型）小鼠中开展，每组5只小鼠接受肽段疫苗（200μg）与poly(I:C)佐剂联合治疗。

结果

3.1 新抗原预测效能比较

在4T1细胞中，RNA-seq方法鉴定107个候选新抗原，传统方法鉴定99个，重叠40个；LLC细胞中分别鉴定559个和512个新抗原，重叠193个。RNA-seq显示出更广泛的突变检测范围，包括非经典阅读框来源的变异。

3.2 T细胞免疫原性验证

4T1模型中6个RNA来源新抗原（M1/H2、M3/Rpl9、M4/Lyst、M5/Zfr、M9/Eppk1、M10/Gm10093）诱导显著IFN-γ分泌，传统方法仅3个肽段（C2/Sh3d21、C3/Icmt、C8/Zfr）有效。LLC模型中5个RNA来源肽段（LR2/Plekho1、LR4/Tmem101、LR6/Zscan21、LR9/Nckap1、LR10/Plin2）显示强免疫原性，传统方法4个肽段（LC2/Eya3、LC6/C77080、LC7/Ewsr1、LC8/Arid1a）有效。

3.3 体内抗肿瘤疗效

RNA肽段疫苗组在4T1和LLC模型中均呈现最优抑瘤效果（P<0.0001），肿瘤组织CD3⁺/CD137⁺T细胞浸润显著增加。生存分析显示RNA肽段组小鼠生存期延长最显著（4T1模型延至32天，LLC模型延至46天），且治疗期间体重稳定增长。

3.4 临床样本验证

乳腺癌患者样本中鉴定出6个合成肽段，其中3个（H1/DEPDC1、H4/WDR7、H6/TGIF2）可诱导患者PBMCs产生特异性IFN-γ应答，证实RNA-seq方法在临床样本中的适用性。

讨论

本研究通过功能实验验证了RNA-seq单独预测新抗原的可行性，其优势在于：1）捕获非编码区突变和RNA编辑事件；2）同步提供HLA分型和表达定量数据；3）显著降低检测成本和时间。与ASNEO、INTEGRATE-neo等现有工具相比，本研究首次提供从计算预测到体内外功能验证的完整证据链。局限性包括临床样本量单一和缺乏细胞毒性实验深度验证，但为低TMB肿瘤（如乳腺癌）的免疫治疗提供了新方向。

结论

仅基于RNA测序的新抗原预测策略可有效鉴定免疫原性肽段，并通过疫苗形式激发抗肿瘤免疫应答。该技术框架有望成为个性化癌症免疫治疗的重要组件，但其临床转化仍需更大规模队列研究验证。