超支化聚-L-赖氨酸（HBPL）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌机制及其与常规抗生素的协同和拮抗作用研究

本综述深入探讨了超支化聚-L-赖氨酸（HBPL）作为新型抗菌聚合物，通过多模式物理破坏机制（包括静电结合、膜透化及细胞裂解）有效对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。研究揭示了HBPL对生物膜形成的显著抑制能力（浓度1.0 mg/mL时抑制率达73–87%），并阐明了其与左氧氟沙星（协同，FICI≤0.5）、替加环素（相加）及达托霉素（拮抗，FICI>4）的机制依赖性相互作用，为耐药菌感染的治疗提供了新策略。

　　

引言

21世纪以来，抗菌药物耐药性（AMR）的蔓延已成为全球公共卫生的重大威胁。据《柳叶刀》发布的全球抗菌药物耐药性研究（GRAM）项目估计，2019年AMR直接导致127万人死亡，这一数字超过了艾滋病或疟疾的年死亡率。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）因其卓越的遗传可塑性，能够对几乎所有投入临床使用的抗生素类别产生耐药性。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和全球传播正是这一挑战的缩影。该病原体将多药耐药性与强毒力因子相结合，使得开发新型抗MRSA策略成为全球公共卫生的首要目标。

MRSA的临床挑战远不止于基因编码的耐药机制。其两大关键生存策略——生物膜形成和持留菌（Persister cells）的产生——为病原体构筑了抵御宿主免疫和抗菌治疗的坚固堡垒。生物膜是包裹在自我产生的胞外聚合物（EPS）基质中的结构化细菌群落，可黏附于生物表面和医疗植入物。在这些生物膜内部以及浮游菌群中，存在着一群休眠的、代谢不活跃的细菌，即“持留菌”。这些细胞并非遗传性耐药，而是表现出对抗生素的表型耐受，因为药物作用的靶点——如DNA、蛋白质或细胞壁合成等活跃过程——被下调或失活。一旦抗生素治疗停止，这些持留菌便可复苏，导致感染复发。

在寻找新型抗菌剂的过程中，自然界以宿主防御肽（HDPs），即抗菌肽（AMPs）的形式提供了一个引人注目的蓝图。AMPs具有广谱抗菌活性，其作用机制主要涉及与微生物细胞膜的静电相互作用和物理破坏。然而，尽管前景广阔，天然AMPs的临床转化仍面临诸多挑战，包括制造成本高、易受蛋白酶降解、以及对pH值和盐浓度等生理条件敏感，这些都限制了其稳定性和生物利用度。

为克服天然AMPs的局限性，研究人员转向设计合成抗菌聚合物，以模拟其基本特征，同时提供更优异的稳定性和可扩展性。阳离子聚合物尤其成为一类极具前景的治疗剂。这些大分子经过工程设计，可呈现高密度的正电荷，使其能够静电靶向细菌细胞包膜的净负电表面。初始结合后，聚合物的两亲性促进其插入脂质双层，导致膜 destabilization、孔道形成、细胞内容物泄漏，并最终导致细菌快速死亡。聚合物化学的多样性允许精确调整分子结构、电荷密度和疏水性，以优化抗菌功效，同时最大限度地减少对哺乳动物细胞的毒性。

在众多抗菌聚合物结构中，本研究聚焦于超支化聚-L-赖氨酸（HBPL），一种由L-赖氨酸氨基酸构建的合成聚合物。其超支化结构提供了具有高浓度末端伯胺基团的紧凑结构，这些基团在杀菌生理pH下质子化，赋予聚合物强阳离子电荷。使用L-赖氨酸作为单体是一个关键的设计特征，赋予了优异的生物相容性和潜在的可生物降解性，这对医疗应用至关重要。先前的研究已证明了HBPL在各种生物医学背景下的潜力，例如作为医疗器械抗菌涂层和先进伤口敷料的组成部分，确立了其作为多功能抗菌生物材料的前景。尽管HBPL已展现出潜力，但其对MRSA这类关键临床病原体的基本抗菌机制的全面理解仍不完整。此外，其作为佐剂与常规抗生素联用的能力——一项对抗多药耐药性的关键策略——尚未得到初步研究。这一知识缺口阻碍了基于HBPL的疗法的合理设计。

结果

HBPL的理化表征

研究首先对HBPL与细菌细胞相互作用的基础性质进行了表征。Zeta电位分析显示，0.5 mg/mL的HBPL水分散体在pH 7时具有30.3 ± 1.0 mV的净正表面电荷。这种正电势证实了该聚合物在杀菌生理pH下的阳离子性质，这对于其初始静电吸引带负电的细菌表面至关重要。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱用于确认其化学结构。所得光谱显示出两个特征吸收带：一个以3,279 cm^?1为中心的宽伸缩峰，对应于N–H振动；一个在约1,637 cm^?1处的强峰，归属于酰胺I带（C=O伸缩）和N–H弯曲振动。这些光谱特征与聚-L-赖氨酸的分子结构一致，证实了其富含决定其化学特性和功能的胺和酰胺官能团。HBPL的数均分子量（M_n）和重均分子量（M_w）分别为3,114和4,532。其多分散指数（PDI）为1.46，表明分子量分布较宽，存在分子量差异。HBPL的支化度为0.48，表明其具有高度支化的结构，这有助于其优异的水溶性。

HBPL对MRSA表现出杀菌活性

通过微量肉汤稀释法评估了HBPL对三种MRSA菌株（包括标准菌株ATCC 43300 (MRSA 1) 和两种临床分离株 (MRSA 2, MRSA 3)）的体外抗菌效力。HBPL对所有菌株均表现出持续且强大的活性。所有三种菌株的最低抑菌浓度（MIC）均为0.5 mg/mL。最低杀菌浓度（MBC），定义为导致初始接种量减少≥ 99.9%的最低浓度，为1.0 mg/mL。较低的MBC/MIC比值（2）表明HBPL是杀菌剂而非抑菌剂。

通过生长曲线和时间-杀菌动力学试验进一步探究了其杀菌活性的动态变化。生长曲线分析显示，HBPL对MRSA增殖具有浓度依赖性的抑制作用。在0.5 × MIC (0.25 mg/mL)、MIC (0.5 mg/mL) 和2 × MIC (1.0 mg/mL) 的HBPL存在下，与未处理的对照组相比，细菌的延滞期显著延长。在2 × MIC浓度下，在48小时的孵育期内未观察到光密度的显著增加，表明生长受到抑制。时间-杀菌动力学试验证实了HBPL作用的快速性。在2 × MIC (1.0 mg/mL) 浓度下，HBPL在6小时内即可完全清除（>5-log减少）初始接种量为5 × 10⁵ CFU/mL的细菌。即使在MIC浓度下，HBPL也在12小时内诱导了显著的细菌杀灭， demonstrating a potent and time-dependent bactericidal effect.

HBPL诱导MRSA细胞包膜发生不可逆损伤

采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）在细胞水平可视化其作用机制。使用双荧光染色（SYTO 9用于膜完整的活细胞，碘化丙啶（PI）用于膜受损的死细胞）的CLSM提供了膜破坏的直接证据。未经处理的对照MRSA细胞发出明亮的绿色荧光，表明膜完整。相反，用MIC和2 × MIC浓度的HBPL处理6小时后，观察到荧光发生浓度依赖性变化。绿色细胞群减少，而发出红色荧光的细胞占主导地位，这表明膜完整性遭到破坏，允许PI进入并染色细菌核酸。

SEM提供了这种损伤的高分辨率形态学细节。对照MRSA细胞呈现为均匀、表面光滑的球体，是健康葡萄球菌的典型形态。用0.5 mg/mL HBPL处理后，诱导出可见的表面损伤，包括凹坑和凹陷，并导致细胞聚集。在1.0 mg/mL浓度下，观察到更严重的损伤，其特征是细胞壁内陷、膜塌陷和细胞碎片的形成。这些图像提供了确凿的视觉证据，表明HBPL的主要作用模式涉及对细菌细胞包膜的物理破坏。

HBPL破坏生物膜形成并影响细胞蛋白质谱

鉴于生物膜在MRSA发病机制中的关键作用，使用结晶紫染色法定量评估了HBPL抑制其形成的能力。实验结果表明，HBPL具有浓度依赖性的抗生物膜效应。在0.25 mg/mL (0.5 × MIC) 和0.5 mg/mL (MIC) 浓度下，HBPL显著减少了与未处理对照组相比的生物膜生物量。在最高浓度1.0 mg/mL (2 × MIC) 下，HBPL对三种MRSA菌株的生物膜形成抑制率分别为87%、73%和81%。这表明HBPL可以干扰生物膜发展的初始阶段。

为了评估HBPL处理对细胞代谢的更广泛下游效应，通过SDS-PAGE分析了经处理和未经处理的MRSA1的总蛋白提取物。未经处理的对照细胞的蛋白质谱显示出强烈染色的条带。随着HBPL处理浓度的增加，观察到清晰的浓度依赖性效应：蛋白质条带逐渐变淡变窄，在较高浓度下一些条带完全消失。这种可检测蛋白质的全局性减少表明，HBPL引起的膜破坏导致了广泛的代谢崩溃， either through the leakage of cytoplasmic proteins, the halting of protein synthesis, or subsequent protein degradation.

长时间暴露于HBPL诱导稳定、低水平耐药性

为研究耐药性发展的可能性（任何新抗菌剂的关键考虑因素），将MRSA1在浓度递增的HBPL存在下进行连续传代培养，共24代。MIC值逐渐增加，在前4代内增加了四倍，最终稳定在比亲本菌株初始MIC高64倍的水平。在没有HBPL的情况下，MRSA1的MIC仅增加了一个稀释梯度。为评估这种获得性表型的稳定性，将适应菌株在无药物培养基中连续传代4次。升高的MIC并未恢复到基线水平，表明诱导的耐药性是一个稳定性状。

对适应菌株进行革兰氏染色揭示了惊人的形态和生理变化。虽然亲本菌株表现出典型的革兰氏阳性特征（紫色染色，均匀的球菌），但HBPL适应菌株显示出部分向革兰氏阴性样染色（粉红色/红色细胞）的转变，并且细胞尺寸明显增加。这些观察结果表明，敏感性降低的机制涉及细菌细胞包膜的结构重塑。

为评估这种适应的适应性代价，在无HBPL培养基中对亲本菌株和HBPL适应菌株进行了比较生长曲线分析。适应菌株表现出降低的最大生长速率。这表明与获得性耐药性相关的适应性缺陷。

HBPL在联合治疗中表现出药物特异性的协同和拮抗相互作用

使用棋盘格试验初步评估了HBPL作为常规抗生素佐剂的潜力。通过计算分级抑菌浓度指数（FICI）将相互作用分类为协同、相加、无关或拮抗。结果表明了特定的、机制依赖性的相互作用。

协同作用（FICI ≤ 0.5）：当HBPL与氟喹诺酮类药物左氧氟沙星联合时，观察到一致且强大的协同效应。三种菌株的FICI值分别为0.500、0.266和0.266，表明联合用药可能比单独使用任一药物更有效，指向潜在的协同相互作用。如图6所示，OD₆₀₀ nm值大于0.1表示细菌生长。红框标出了单药对MRSA2的MIC。观察到HBPL联合的MIC为0.125 mg/mL，而左氧氟沙星联合的MIC为0.25 μg/mL。蓝框标出了FICI计算孔，该孔的FICI值为0.266，小于0.5，表明左氧氟沙星与HBPL之间存在协同相互作用。

相加作用（0.5 < FICI ≤ 1.0）：与替加环素（一种甘氨酰环素类药物）发现了相加相互作用（FICI值：0.756, 0.628, 0.756）。这表明联合效应大致等于它们各自效应的总和。

无关作用（1.0 < FICI ≤ 4.0）和拮抗作用（FICI > 4.0）：HBPL与达托霉素（一种环脂肽抗生素）联合，对MRSA1和MRSA3产生无关作用（FICI: 2.125, 2.500），对MRSA2产生明确的拮抗作用（FICI: 4.125）。这表明联合用药的效果不如单独使用任一药物。

这些结果表明，将HBPL与抗生素联合使用的效果并非随意，而很可能受到合作药物特定作用机制的影响。

讨论

本研究对HBPL作为抗MRSA剂进行了全面的机制评估，揭示了一种多模式的作用机制、强大的抗生物膜活性以及与常规抗生素联合时的特异性相互作用。这些发现不仅将HBPL定位为一种有前景的抗菌聚合物，而且为合理设计针对多药耐药病原体的联合疗法提供了见解。

本研究的集体证据汇聚起来，支持一个快速的、物理介导的杀菌活性模型。与靶向特定酶或代谢途径的传统抗生素不同，HBPL的作用是对MRSA细胞包膜结构完整性的直接攻击。该过程始于阳离子HBPL与金黄色葡萄球菌细胞壁净负电表面之间的静电吸引。在革兰氏阳性菌中，这种负电荷主要由肽聚糖中共价连接的阴离子聚合物壁磷壁酸（WTA）中丰富的磷酸基团所赋予。这种基于电荷的“对接”是至关重要的第一步，将聚合物浓缩在细菌表面。吸附后，HBPL穿透并破坏细胞质膜。CLSM结果明确证明了这一点，膜不通透染料PI的内流表明膜损伤。该机制类似于其他膜活性剂，其中两亲分子插入脂质双层，破坏其组织，导致孔道或瞬时缺陷的形成。高分辨率SEM图像显示的表面凹坑、内陷和最终的细胞塌陷，为这一破坏过程提供了形态学佐证。

膜完整性的丧失具有直接且致命的后果。它导致质子动力的消散、必需离子和小分子代谢物的泄漏，以及无法维持细胞稳态。这解释了在时间-杀菌试验中观察到的快速的、浓度依赖性的杀灭作用。在SDS-PAGE上看到的细胞蛋白质条带的全局性减少是这种崩溃的下游后果，反映了蛋白质从受损细胞泄漏、由于能量耗尽而停止蛋白质合成以及被释放的蛋白酶潜在降解的综合结果。这种多方面的物理攻击为细菌提供了很少的成功防御途径，解释了其杀菌效果。

HBPL在1.0 mg/mL浓度下分别抑制三种MRSA菌株生物膜形成达87%、73%和81%的能力是一个具有治疗意义的关键发现。这种强大的活性可能源于双重机制。主要作用模式是防止初始附着阶段。生物膜始于浮游细菌黏附到表面。正如时间-杀菌试验所证明的，HBPL能迅速清除这些自由漂浮的细胞，在生物膜建立之前就有效地中和其构建模块。其次，阳离子聚合物可以直接干扰EPS基质的完整性。基质由各种组分维系，包括带负电的eDNA。HBPL的阳离子性质可能使其能够结合并破坏这种eDNA支架，从而 destabilizing the biofilm structure。此外，HBPL引起的膜破坏可能干扰细菌通讯系统，如群体感应，这对协调生物膜成熟至关重要。

经过连续的浓度梯度HBPL处理后，MRSA1的MIC增加了64倍，而在没有HBPL的情况下，MRSA1的MIC仅增加了一个稀释度。这是一个重要的发现，需要进一步解释。这并不代表通过单一靶点突变获得耐药性，如同许多传统抗生素常见的那样。相反，它反映了一种复杂的、适应性的应激反应，涉及细胞包膜的重大 overhaul。观察到的惊人形态变化——向革兰氏阴性样染色转变和细胞肿胀——是这种重塑的表型证据。为评估这种适应的适应性代价，在无HBPL培养基中对亲本菌株和HBPL适应菌株进行了比较生长曲线分析。适应菌株表现出降低的最大生长速率，表明与获得性耐药性相关的适应性缺陷。这种适应性代价可能会限制此类耐药变体在缺乏HBPL持续选择压力下的持久性和传播。这种适应的一个合理的分子机制涉及细胞表面电荷的修饰，以减少与阳离子聚合物的静电吸引。细菌已经进化出复杂的系统来抵抗阳离子AMPs，包括磷壁酸的D-丙氨酰化（由