在ICCVAM科学可信度框架下通过推断性能筛选重现雌激素受体α激动剂的人体相关效能阈值（HRPT）的研究及其监管意义

本综述系统评估了科学可信度框架（SCF）作为新方法（NAM）验证的替代方案，重点分析了雌激素受体α（ERα）激动剂的人体相关效能阈值（HRPT）的建立与应用。通过重现Borgert等人的研究，证实HRPT在预测临床子宫内膜及宫颈效应中的有效性，并论证了推断性能评估（Inference Performance）在ICCVAM和ACC框架中的核心作用。研究为NAM在内分泌干扰筛查及动物试验替代策略中的应用提供了关键科学依据。

　　

引言

科学可信度框架（SCF）正逐渐成为传统验证方法的替代方案，用于评估新方法（NAM）在监管中的应用。美国替代方法验证跨部门协调委员会（ICCVAM）和美国化学理事会（ACC）各自开发的SCF均关注推断性能——即NAM预测或指示目标生物学效应的能力。ACC的SCF将推断性能作为独立评估步骤，而ICCVAM则将其融入多个环节。本研究首先重现了Borgert等人此前通过指南及类指南研究推导的雌激素受体α（ERα）激动剂人体相关效能阈值（HRPT），发现1至10^–1的HRPT能一致且准确地预测临床子宫内膜和宫颈效应。随后，将推断性能映射至ICCVAM的SCF，证明其可作为深入表征前的有效初筛工具。最终得出结论：基于明确作用模式（MOA）的ERα激动剂HRPT（10^–2至10^–4）是一种健康保护性NAM，可像毒理学关注阈值（TTC）一样用于早期筛查；同时强调推断性能是SCF的核心要求。

NAM的定义源自美国环保署（EPA）2018年战略计划，指任何可替代完整动物试验的化学危害与风险评估技术或方法。经济合作与发展组织（OECD）长期通过多实验室环试（ring trials）验证NAM，但该过程耗时费力，难以跟上技术发展和监管需求，因此适合目的验证（fit-for-purpose validation）概念应运而生。ACC的SCF在此基础上逐步发展，最初透明评估体外（Tox21） assays及EPA内分泌干扰筛查计划（EDSP）中雌激素、雄激素、甲状腺、类固醇生成（EATS）结局的预测模型，后扩展至不良结局通路（AOP）评估，最终形成七步框架：假设提出、生物模型、检测性能、推断性能、透明传播、论证叙述和同行评审。推断性能作为独立步骤，评估NAM终点预测目标结局的能力，即“响应-响应关系”，是该框架的特色。

ICCVAM的SCF与ACC框架相似，但将推断性能融入技术表征步骤，且未单独设置论证叙述。内分泌干扰筛查是NAM应用较早的领域，EPA的EDSP利用NAM分层策略识别由内分泌MOA引起的整体生物体危害。雌激素受体转录激活（ERTA）体外检测和啮齿类子宫肥大试验（rodent uterotrophic assay）分别测量ERα亲和力与活性的机制效能，但二者高度敏感，可能检测到人体中无活性的低效能物质。为此，Borgert等人通过对比ERα激动剂相对于雌二醇（E2）或药物激动剂（如炔雌醇EE2、己烯雌酚DES）的机制效能与临床可观察雌激素效应，推导出HRPT，确定1×10^?4相对效能为“不可能引起人体不良效应的保守阈值”。HRPT基于明确MOA，可像TTC一样用于分层策略，减少后续动物试验需求。

材料与方法

ERTA和子宫肥大试验数据来自OECD测试指南（TG）No.455“稳定转染转录激活体外检测ER激动剂和拮抗剂的性能基准指南”中的VM7Luc ER TA assay EC₅₀值，以及Kleinstreuer等人整理的类指南（GLL）研究数据库（UTDB）。活性物质EC₅₀通过已发表剂量响应曲线视觉估算或利用GraphPad Prism v.10.4.1拟合均值、标准差和样本数数据，结果以相对于EE2的相对效能表示。

人体临床关联效应限于与子宫肥大试验相关的子宫内膜和宫颈增厚、增生及癌症。分析物质包括内源性激动剂或有临床/膳食暴露的ERα激动剂：E2、17α-E2、EE2、DES、大豆苷元、雌酮（E1）、金雀异黄素、己烷雌酚和利血平。其中大豆苷元、己烷雌酚和利血平因仅单剂量阳性无法推导EC₅₀，最终分析E1、E2、17α-E2、EE2、DES和金雀异黄素。临床数据来源包括EFSA食品添加剂和营养源专家组（ANS）对异黄酮的综述、PubMed检索的子宫内膜安全性研究，以及内源性雌激素E1和17α-E2的治疗与安全信息。

推断性能评估（ACC SCF Step 4）通过比较ERTA和子宫肥大试验相对效能与临床数据，判断是否在≥1×10^?4时预测临床效应，并对比ICCVAM与ACC框架的相应元素。

结果

ERTA和子宫肥大试验数据与Borgert等人结果基本一致，仅雌酮相对效能差异超过100倍，可能源于研究间暴露途径（ip vs. sc）不同。临床可观察子宫内膜效应分析显示，唯一符合EMA指南且统计功效充足的研究（Palacios等人）表明70mg/天异黄酮（50%大豆苷元、30% Glyceitin、20%金雀异黄素）治疗1年无子宫内膜增生或癌变。E1通过子宫内膜中17β-羟类固醇脱氢酶转化为E2驱动增生/癌症，17α-E2无相关风险。

相对机制效能评估表明，Within十倍E2或EE2效能的物质预测人体子宫内膜增生/癌症，更低效能物质则无此效应。推断性能评估证实HRPT在10^?2或更低时可保护人体免受临床效应影响，满足ACC SCF Step 4。ICCVAM SCF中，ACC Step 4通过提供NAM响应预测目标响应程度的信息，告知使用背景（Step 1）、生物相关性（Step 2）、性能标准与使用限制（Step 3）及透明度（Step 5），数据完整性（ICCVAM Step 4）和同行评审（ICCVAM Step 6）分别对应ACC Step 3/5和Step 7。

讨论

基于Palacios等人研究，口服异黄酮至70mg/天无子宫内膜增殖或致癌效应。人体响应仅见于相对效能Within 10^–1的物质，表明HRPT≤10^–2对人体 examined endpoints具保护性，验证了Borgert等人1×10^?4为保守阈值的结论。Borgert等人新近研究通过经典受体占据模型证明该阈值保守性至少10倍，与本研究一致。HRPT ERα激动剂NAM可作TTC或豁免动物试验标准。

推断性能评估清晰证明机制效能Within十倍E2/EE2的物质在暴露量、时长和频率足够时可预测人体子宫内膜增生/癌症，HRPT≤10^?2则无此效应，满足ACC SCF Step 4。使用指南和类指南研究构建或验证NAM可满足ICCVAM SCF更多条件，尽管SCF常被视为适合目的替代方案，但HRPT此类复杂NAM嵌入两个子NAM（ERTA和子宫肥大试验），且涉及人体临床数据，故指南研究相关性高。其他NAM可能无指南数据，但本研究证明监管场景中指南研究与SCF兼容。

结论

监管科学界有共同责任确保NAM适合目的，SCF提供宝贵操作框架。ICCVAM指南中虽隐含推断性能概念（如生物相关性、参考化合物、与现有动物方法比较、统计模型开发、数据解读程序），但实施时建议增设专门章节明确分析NAM推断性能，关键评估并透明记录NAM结果或模型预测目标结局的程度。