多组学解析白芷提取物通过肠菌-代谢物-脑轴调控缓解大鼠偏头痛的机制

《Frontiers in Pharmacology》：Multi-omics analysis reveals Angelica dahurica radix extract alleviates migraine in rats via gut microbiota-metabolome-gut-brain axis regulation

本研究揭示中药白芷（Angelica dahurica Radix）提取物通过重塑肠道菌群（如提升乳杆菌/Lactobacillus）、修复肠屏障（上调Occludin/ZO-1）、调节神经递质（5-HT、CGRP1、TNF-α、NO、PGE2、DA）和代谢通路（色氨酸代谢、花生四烯酸代谢等），多靶点缓解硝酸甘油（NTG）诱导的偏头痛，为“肠-脑轴”理论提供了药理学依据。

　　

1 引言

偏头痛是一种常见的原发性头痛疾病，在全球范围内造成沉重的疾病负担。2019年全球偏头痛患者人数已达8760万，相比1990年增长40.1%。其发病机制涉及神经血管功能障碍、神经递质失衡（如血清素和降钙素基因相关肽）、遗传易感性和离子通道异常等多因素机制，尚未完全阐明。

中药在偏头痛治疗中展现出独特优势，其中白芷（Angelica dahurica Radix，BZ）作为传统中药，具有祛风除湿、止痛、通鼻窍的功效，在《本草纲目》等经典著作中被记载“祛风止痛，尤善治风寒头痛”。现代药理研究表明，白芷中的活性成分（如欧前胡素和异欧前胡素等香豆素类化合物）可通过调节钙依赖信号通路影响脑血管张力，缓解病理血管收缩引起的偏头痛症状。其挥发油成分能够穿透血脑屏障（BBB），影响中枢神经递质代谢，如稳定5-HT水平，并通过抑制促炎介质（如IL-1β和TNF-α）发挥抗炎作用。

近年来，神经胃肠病学的发展强调“肠-脑轴”作为关键的双向通信网络，整合了肠道菌群、肠屏障完整性、免疫反应、迷走神经信号和神经内分泌通路。微生物干预措施（如益生菌、粪便微生物移植）在临床前模型中显示出缓解神经行为缺陷的潜力，表明其在偏头痛管理中的应用前景。本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）和16S rRNA测序技术，分析经白芷处理的硝酸甘油（NTG）诱导偏头痛大鼠模型的血浆代谢组学和肠道菌群组成，通过多组学整合方法，旨在阐明白芷通过调节菌群失调和宿主代谢途径的治疗机制。

2 材料与方法

2.1 白芷提取物的制备

白芷购自河北保定，经成都中医药大学江桂华教授鉴定为白Angelica dahurica的干燥根。200g白芷加10倍量双蒸水浸泡1小时后煎煮30分钟，过滤后滤渣再加8倍量水煮沸30分钟，合并两次煎煮液，浓缩至0.5g生药/mL，4℃保存，干膏得率为10.77%。

2.2 白芷化学成分定性定量分析

采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）进行定性分析，使用Waters CORTECS T3 UPLC C18色谱柱，流动相为0.1%乙酸水溶液-乙腈，梯度洗脱。通过TOF MS-IDA-MS/MS模式进行正负离子扫描，鉴定出40种化学成分，包括香豆素类、核苷类、有机酸类、黄酮类、糖类和氨基酸类。

定量分析采用高效液相色谱法（HPLC），使用Agilent 1260 Infinity Ⅱ系统，COSMOSIL C18-MS-II色谱柱，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱，检测波长300nm。测定白芷提取物中氧化前胡素水合物（0.2193mg/g）、比克白芷素（0.2101mg/g）和佛手柑内酯（0.0152mg/g）的含量。

2.3 动物实验

SPF级雄性Wistar大鼠（190±20g）适应环境1周后，随机分为4组：正常组（Normal）、模型组（Model）、白芷组（BZ）和阳性药组（舒马普坦琥珀酸注射液，SS）。正常组和模型组灌胃无菌水（10mL/kg），BZ组灌胃白芷提取物（7.2g生药/kg，相当于0.78g提取物/kg），连续14天。除正常组外，其余组每隔一天皮下注射NTG（10mg/kg）诱导偏头痛样症状，共5次。

2.4 血浆和脑组织生化指标测定

采用ELISA试剂盒检测大鼠血浆和脑组织中5-HT、NO、CGRP₁、ET-1、PGE₂、TNF-α和DA的浓度。

2.5 组织病理学检查

结肠组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行H&E染色，光镜下观察炎症细胞浸润、黏膜上皮坏死、隐窝变性和固有层水肿等病理变化。

2.6 免疫组化染色

检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达。脱蜡切片经抗原修复后，与一抗（抗Occludin和抗ZO-1）4℃孵育过夜，随后与HRP标记的二抗室温孵育1小时，DAB显色，苏木精复染核，ImageJ软件计算积分光密度（AOD）。

2.7 16S rRNA微生物群落分析

采用E.Z.N.A.?土壤DNA试剂盒提取粪便微生物DNA，扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区，使用MiSeq测序仪进行测序。序列经质量控制和过滤后，以97%相似度聚类为OTUs，使用UPARSE软件去除嵌合序列。通过主坐标分析（PCoA）、Venn图和线性判别分析（LEfSe）评估细菌群落结构差异。

2.8 血清代谢组学分析

血清样本用冷甲醇提取，经超声、离心后取上清液，采用ThermoFisher UHPLC-Orbitrap质谱系统进行分析。ESI正负离子模式检测，扫描范围m/z 100-1500。原始数据经Compound Discoverer 3.3软件处理，进行峰对齐、提取和分子式拟合，二级质谱图与mzCloud、mzvault网络数据库和本地中药成分数据库OTCML匹配。采用MetaboAnalyst 6.0和Metware Cloud进行PCA、PLS-DA、热图分析以及代谢富集和通路分析。差异代谢物筛选标准为VIP≥1.0，p<0.05，FDR≤0.2。

2.9 代谢物与肠道菌群相关性分析

采用Spearman相关系数分析代谢物与菌群之间的线性相关性，r>0.6表示显著正相关，r<-0.6表示显著负相关。

2.10 统计分析

数据以均值±标准误（SEM）表示，使用GraphPad Prism 10.4软件进行统计分析。两组间比较采用t检验或Mann-Whitney U检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）后Tukey多重比较检验，p<0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 白芷水提物化学成分

通过UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS鉴定出40种化学成分，包括香豆素类、核苷类、有机酸类、黄酮类、糖类和氨基酸类。定量分析显示氧化前胡素水合物、比克白芷素和佛手柑内酯的含量分别为0.2193mg/g、0.2101mg/g和0.0152mg/g。

3.2 白芷改善NTG诱导的偏头痛症状

模型组体重略有下降，BZ和SS治疗组体重增长趋势与正常组相似。NTG注射后挠头次数增加，模型组120分钟内平均挠头次数为113次，BZ组较模型组减少61.2%（p<0.01）。ELISA检测显示，模型组血浆和脑组织中5-HT、NO、CGRP₁、TNF-α、PGE₂和DA水平显著升高，BZ组这些指标显著降低。在脑组织中，BZ组CGRP₁降低9.6%（p<0.05），DA降低7.5%（p>0.05），5-HT降低11.5%（p<0.05），TNF-α降低9.7%（p<0.05），PGE₂降低7.2%（p>0.05），NO降低20.5%（p<0.01）。在血浆中，BZ组CGRP₁降低20.5%（p<0.01），DA降低20.3%（p<0.05），5-HT降低24.2%（p<0.01），TNF-α降低31.2%（p<0.01），NO降低20.2%（p<0.01），ET-1降低17.6%（p<0.05）。表明白芷给药缓解了NTG诱导的偏头痛样症状。

3.3 白芷增强NTG诱导大鼠的肠屏障功能

肠屏障功能障碍在偏头痛发病中起重要作用。H&E染色显示模型组结肠组织损伤严重：黏膜层破坏、腺体扭曲、大量炎症细胞浸润和上皮细胞脱落。BZ组炎症细胞显著减少，黏膜完整性恢复，腺体更规则，上皮脱落减少。免疫组化显示，NTG诱导的偏头痛模型大鼠中Occludin和ZO-1蛋白表达水平显著降低，BZ治疗后显著升高。表明白芷恢复了NTG诱导偏头痛大鼠受损的肠屏障功能。

3.4 白芷调节NTG诱导大鼠的肠道菌群组成

Venn图显示正常组、模型组和BZ组仅共享203个OTUs，BZ组有492个独特OTUs，正常组和模型组分别有804和620个，表明白芷处理引起菌群特异性重组。PCoA分析（PC1:22.03%，PC2:16.26%）表明白芷能够将微生物β多样性向正常聚类方向移动。α多样性指标显示偏头痛相关失调：模型组Shannon指数和InvSimpson指数升高，表明确病理性的高多样性，BZ治疗使这些指数正常化，恢复微生物群落平衡。

在门水平上，偏头痛大鼠厚壁菌门（Firmicutes）减少，拟杆菌门（Bacteroidetes）增加，降低了F/B比值；白芷逆转了这一变化，提高了厚壁菌门的相对丰度，抑制了拟杆菌门。F/B比值是肠道菌群平衡的关键指标，模型组F/B比值高于正常组表明确偏头痛诱导的肠道菌群失调，BZ降低了F/B比值，表明白芷恢复菌群平衡，可能有助于其抗偏头痛作用。

在属水平上，模型组乳酸杆菌属（Lactobacillus）和未分类拟杆菌目（Unassigned_Bacteroidales）的相对丰度较正常组显著增加，BZ组这些属的相对丰度降低，接近正常组水平。表明白芷治疗可能在属水平调节肠道菌群组成。

LEfSe分析（LDA>3.0，p<0.05）鉴定出32个 discriminatory taxa。正常组以乳酸杆菌为主，反映肠道稳态；模型组富集了促炎 taxa，包括[Ruminococcus] torques group和拟杆菌属；BZ组表现出独特的菌群特征，以丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和肠杆菌目（Enterobacteriales）为特征，同时显著抑制偏头痛相关的[Ruminococcus] gnavus group。条形图显示白芷介导的有益乳酸杆菌丰度恢复，与5-HT恢复相关，而致病性卟啉单胞菌属（Porphyromonas）减少，与ZO-1上调一致。

3.5 白芷调节NTG诱导大鼠的血清代谢组学

非靶向代谢组学显示，与正常组相比，模型组大量代谢物发生显著改变，表明确偏头痛模型的建立导致大鼠代谢物谱发生实质性变化。PLS-DA分析显示正常组与模型组明显分离。丰度分析和随机森林分析确定了前15种最相关的物质，验证了正常组、模型组和BZ组之间的相似性和差异性。

火山图确认了正常组与模型组以及模型组与BZ组之间的相似性和差异性。进一步分析显示，与正常组相比，模型组多种代谢物的相对峰面积显著改变。代谢通路分析显示，花生四烯酸代谢等通路具有高-log10(p)值和较高的通路影响，表明与观察到的代谢变化显著相关。其他通路，包括叶酸介导的一碳池和苯丙氨酸代谢，也显示出不同程度的显著性和影响。

BZ治疗后，包括4-氨基-3-羟基苯甲酸和前列腺素A1在内的多种代谢物的相对峰面积呈现向正常组水平恢复的趋势。其中，与CGRP₁抑制相关的2-AG和与NF-κB磷酸化降低相关的8-epi-PGF2α可能在白芷治疗反应和不同组间潜在生物过程中起关键作用。代谢通路分析发现花生四烯酸代谢显著富集，这与偏头痛的神经炎症反应有关。

3.6 肠道菌群、代谢物与偏头痛相关指标的相关性分析

Spearman相关分析热图阐明了血清代谢物与菌属之间以及菌群代谢物与脑组织偏头痛相关指标（5-HT、CGRP₁、TNF-α、IL-1β和NO等）和与肠通透性密切相关的指标（ZO-1、Occludin）之间的关系。N-乙酰缬氨酸与乳酸杆菌呈正相关，而2,3-二去甲-8-表-前列腺素F2α与[Ruminococcus] gnavus group呈负相关。抗坏血酸与Tyzzerella 4呈正相关，邻苯二甲酸单丁酯与拟杆菌属呈负相关。

关于肠道菌群-偏头痛联系，代谢物对偏头痛相关因子的表达有显著影响。戊二酸酐与NO和TNF-α呈正相关，而6-甲基[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪-8-醇与ZO-1 AOD呈负相关。4-氨基-3-羟基苯甲酸与DA呈正相关，禾草碱与5-HT呈负相关。这些发现揭示了粪便代谢物改变、肠道菌群变化和偏头痛相关因子之间复杂的相互作用，突显了潜在机制的复杂性。

4 讨论

偏头痛是一种复杂的神经系统疾病，其特征是反复发作的头痛和感觉过敏，日益被认为与肠-脑轴失调有关。新兴证据表明，肠道菌群失调通过改变神经活性代谢物（包括短链脂肪酸和色氨酸衍生物）的产生参与偏头痛发病机制，这些代谢物调节中枢伤害性处理和神经炎症级联反应。

本研究阐明白芷治疗机制的新视角，表明白芷通过多靶点网络缓解NTG诱导的偏头痛，包括恢复神经递质平衡、抗炎调节、肠道菌群重组和系统代谢重编程。白芷通过减少血浆和脑组织中5-HT和DA的过度产生，显著减轻偏头痛相关的单胺神经递质失衡。白芷对TNF-α和PGE₂的抑制表明其抑制NF-κB和COX-2通路，与其已知的活性代谢物（如欧前胡素和异欧前胡素）一致。

越来越多的文献证实肠道菌群在偏头痛的发生和加重中起因果作用。从肠道菌群功能角度进一步分析表明白芷干预显著丰富了肠道中乳酸杆菌和[Ruminococcus] gnavus group的丰度。乳酸杆菌和[Ruminococcus] gnavus group的富集可能增强丁酸盐的产生，加强上皮紧密连接，减少细菌内毒素易位。这两组细菌都是肠道中重要的丁酸盐产生菌：乳酸杆菌可通过碳水化合物发酵产生丁酸盐，而[Ruminococcus] gnavus group能够利用肠道中不可消化的多糖合成丁酸盐。丁酸盐作为肠道菌群产生的关键短链脂肪酸之一，不仅是肠上皮细胞促进其增殖和修复的主要能量来源，还通过激活AMPK信号通路增强紧密连接蛋白（如Occludin和ZO-1）的表达和组装，从而进一步加强肠屏障。同时，丁酸盐可以抑制肠道中革兰氏阴性菌的过度增殖，减少细菌内毒素如脂多糖（LPS）的产生和易位，从而降低外周循环中的内毒素水平，缓解全身和中枢神经系统的低度炎症状态——而慢性炎症是偏头痛慢性化和痛觉敏感性增加的关键驱动因素。这种菌群重塑可能抑制由睡眠剥夺等应激源诱导的下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴过度活跃，白芷可能通过迷走神经调节或HPA轴调节进一步减轻应激诱导的菌群失调。

非靶向代谢组学揭示白芷系统调节花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、生物素通路和叶酸介导的一碳代谢。白芷对花生四烯酸代谢的调节可能通过2-AG通路抑制CGRP₁释放，2-AG水平与CGRP₁表达之间的相关性证明了这一点。值得注意的是，乳酸杆菌丰度与2-AG呈正相关，表明菌群介导的脂肪酸酰胺水解酶活性调节。2,3-二去甲-8-表-前列腺素F2α的减少表明氧化应激衍生的前列腺素减少，血脑屏障完整性改善。通路富集分析突显白芷调节色氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸和精氨酸-脯氨酸代谢。色氨酸通路激活促进5-HT合成，而苯丙氨酸/酪氨酸调节稳定儿茶酚胺（DA/去甲肾上腺素）稳态。精氨酸-脯氨酸代谢改变，特别是戊二酸酐积累（与一氧化氮[NO]呈负相关），可能减轻氧化应激和NO过度产生。这些发现表明白芷介导的“线粒体-代谢物-肠轴”，其中乳酸杆菌衍生的代谢物（如吲哚-3-乙酸）可能增强氧化还原平衡和线粒体效率，对抗神经元过度兴奋。

戊二酸酐（线粒体代谢物）与NO之间的负相关——与乳酸杆菌丰度呈正相关——表明菌群依赖的通过氧化应激通路调节NO合成。NO是一种关键的血管扩张剂和神经递质，在偏头痛先兆期间的皮质扩散性抑制中参与。总的来说，白芷协调了一个多维治疗网络，靶向神经递质失衡、神经炎症、肠道菌群组成和代谢失调。白芷驱动的微生物变化产生生物活性代谢物（如禾草碱、水杨酸、前列腺素A1），通过多种途径调节中枢神经功能。

虽然本研究在将肠道菌群-代谢组相互作用与白芷疗效联系起来方面具有开创性，但一些局限性值得关注。首先，样本量限制（每组n=12）和啮齿动物模型在重现人类慢性偏头痛表型方面的固有局限性。基于“剂量越高疗效越显著”的趋势选择单一剂量，但该设计未能捕捉剂量-反应关系——这是未来工作的关键差距。其次，引物特异性和核糖体拷贝数变异可能导致16S rRNA测序偏差。关注分类组成而缺乏功能性微生物组分析。未来研究应通过组蛋白去乙酰化酶（HDAC）/p300-CBP抑制剂研究验证表观遗传调节。探索结合白芷与CGRP₁单克隆抗体的双靶点疗法。解决这些差距可能推进个性化偏头痛治疗， bridging分子见解与临床转化。

5 结论

本研究表明白芷通过肠-脑轴调节缓解偏头痛，恢复神经递质平衡（5-HT/DA），抑制神经炎症（降低TNF-α/PGE₂），并增强肠屏障完整性。它重塑肠道菌群——增加乳酸杆菌丰度同时降低[Ruminococcus] gnavus group丰度——并调节线粒体相关通路，如花生四烯酸/NO轴。这些发现揭示了一个连接传统草药学与神经调节机制的微生物-代谢物-脑调节网络。