CML38介导一氧化氮与钙信号交叉对话抑制拟南芥下胚轴伸长的机制研究

本研究发现拟南芥钙调素类似蛋白CML38通过整合一氧化氮（NO）、钙离子（Ca2+）、光信号和植物激素通路，介导了NO依赖的下胚轴伸长抑制过程。研究揭示CML38作为分子枢纽协调多种信号网络，为植物生长发育与环境适应机制提供了新见解。

　　

1 Introduction

钙离子（Ca²⁺）作为植物中通用的第二信使，通过动态调节胞质钙浓度（[Ca²⁺]cyt）协调生长、发育和应激响应。一氧化氮（NO）作为一种气态信号分子，广泛参与植物生理过程调控。这两种信号分子形成双向交互网络，但其交叉对话的分子机制尚不明确。研究表明钙调素类似蛋白（CML）家族可能介导NO与Ca²⁺信号的交互作用。前期转录组数据显示拟南芥幼苗中CML38表达受外源NO调控，推测CML38可能是NO与Ca²⁺信号交互的关键节点。

2 Materials and methods

以哥伦比亚生态型（Col-0）拟南芥为野生型，采用T-DNA插入突变体cml38（SALK_066538C）。种子灭菌后垂直播种于1/2 MS培养基，施用硝普钠（SNP）作为NO供体，并添加CaCl₂、EGTA（钙螯合剂）或钌红（RR，钙通道抑制剂）。表型分析通过ImageJ量化下胚轴长度。生物信息学分析使用MIB2服务器预测CML38钙结合位点。重组CML38蛋白经原核表达纯化，通过电泳迁移变动实验（EMSA）检测钙结合能力。胞质钙浓度采用Fluo-4 AM荧光探针测定。转录组分析通过RNA-seq技术，使用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），并进行GO和KEGG富集分析。RT-qPCR验证关键基因表达。

3 Results

3.1 CML38 is involved in NO inhibition of hypocotyl elongation

外源NO处理显著下调野生型中CML38表达。表型分析显示NO有效抑制野生型下胚轴伸长，但对cml38突变体无显著影响，表明CML38是NO诱导下胚轴抑制的关键介质。

3.2 Ca²⁺ modulates the regulation of NO on CML38

外源CaCl₂部分缓解NO对野生型下胚轴的抑制，而EGTA或RR增强cml38对NO的敏感性。然而，cml38突变体与野生型在NO触发的[Ca²⁺]cyt升高趋势一致，提示CML38可能作用于初始钙流下游。

3.3 NO does not affect CML38’s Ca²⁺-binding capability

CML38含三个EF-hand钙结合结构域。电泳迁移实验证实其钙结合能力，且NO处理（新鲜SNP vs. 光照降解SNP）未改变其迁移模式，表明NO不影响CML38的钙结合活性。

3.4 Genome-wide identification of CML38-target genes in NO signaling

转录组分析发现cml38突变体在SNP处理下有519个DEGs（168上调，351下调）。层次聚类显示野生型与突变体转录谱显著分离。

3.5 GO enrichment analysis of CML38-regulated DEGs under NO treatment

GO分析识别769个术语，重点关注三类：钙结合与信号转导、光响应（红/远红光和蓝光）、植物激素 biosynthesis and response。cml38中6个钙相关基因差异表达（如NDB4、CPK15、OSCA2.1），23个红/远红光响应基因和8个蓝光响应基因表达改变，且涉及8大类植物激素通路。

3.6 KEGG enrichment analysis of DEGs

KEGG分析显示59条通路富集，包括植物激素信号转导、circadian rhythm、MAPK signaling、ubiquitin mediated proteolysis等代谢途径。

3.7 Validation of transcriptome profiles by RT-qPCR

RT-qPCR验证12个DEGs（如NDB4、CPK15、SPA1、ARR9、PAP1等）表达趋势与RNA-seq一致，确认转录组数据可靠性。

4 Discussion

下胚轴伸长受环境和内源信号精密调控。本研究揭示CML38整合NO、Ca²⁺、光和激素信号网络抑制下胚轴生长。不同于CML23的S-亚硝基化调控机制，CML38的钙结合能力不受NO影响，表明其通过转录调控介导信号交叉对话。CML38缺陷影响钙相关基因（NDB4、CPK15、OSCA2.1）、光信号基因（SPA1、GA3OX1）和激素通路基因表达，提示其通过COP1/SPA-PIF轴、MAPK signaling和ubiquitin proteolysis等多途径协调生长应答。未来需通过遗传上位性分析（如cml38与phyB、pif3、cop1等多突变体杂交）和激素动态监测进一步解析CML38的网络层级。