H2AFZ驱动的增殖性肝癌细胞亚群鉴定及其通过肿瘤-免疫互作影响预后的单细胞转录组研究

本研究通过整合多组单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，系统解析了肝细胞癌（HCC）肿瘤微环境（TME）的细胞组成和功能异质性，鉴定出一类高表达H2AFZ、具强增殖与干性特征的肿瘤细胞亚群（Tumor_C2），实验验证H2AFZ可促进肿瘤增殖与侵袭，并通过细胞通讯分析揭示其与耗竭T细胞（如C2_Exhaustion）及增殖T细胞（C3_Cycling）的密切互作。最后基于Tumor_C2特征构建的预后模型（STRS）在多队列中显著区分患者生存，为HCC精准治疗提供新靶点与策略。

　　

引言

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）作为全球范围内高发的原发性肝脏恶性肿瘤，在中国占据了近半数病例。其发病机制复杂，常由慢性乙型或丙型肝炎病毒（HBV/HCV）感染、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及长期酒精滥用等多种病因驱动。尽管早期HCC可通过肝切除或肝移植进行治疗，中晚期则依赖经动脉化疗栓塞（TACE）或系统性治疗，患者五年生存率仍仅约12.1%，预后极差。这种不良预后与HCC的高度异质性密切相关，包括肿瘤间和肿瘤内异质性，导致治疗响应差异大、机制不明确。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的兴起为在高分辨率下解析肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的细胞组成、状态及互作提供了强大工具。本研究通过整合三个公共scRNA-seq数据集，旨在揭示HCC中肿瘤细胞亚群与免疫细胞之间的相互作用，并探索其与临床预后之间的关联。

材料与方法

本研究使用了来自基因表达汇编（GEO）数据库的三个scRNA-seq数据集（GSE151530、GSE125449和GSE149614），共涵盖28例HCC患者的样本。数据预处理与质量控制通过Seurat包（v4.3.0.1）在R环境中完成，过滤低质量细胞（基因数少于300、线粒体基因含量高于15%或UMI数超过10,000的细胞）。采用DoubletFinder算法剔除双细胞，最终保留41,301个高质量细胞用于下游分析。利用Harmony算法整合数据集并校正批次效应。细胞类型注释通过经典标记基因进行，包括T细胞（CD3E、CD2）、B细胞与浆细胞（CD79A、MZB1）、髓系细胞（C1QB、LYZ）、内皮细胞（PECAM1、CDH5）、成纤维细胞（ACTA2、PDGFRB）以及肿瘤细胞（AMBP、APOA1）。恶性细胞通过inferCNV（以T细胞为参照）进一步确认。肿瘤细胞亚群的分析使用无监督聚类和UMAP降维，功能注释采用Monocle和CytoTRACE进行伪时间分析，细胞互作通过CellChat包探究。H2AFZ的表达与预后分析依托GEPIA2和TCGA-LIHC数据，体外功能实验包括siRNA干扰、Western blot、CCK-8增殖实验、Transwell迁移与侵袭实验、细胞凋亡检测等。预后模型的构建采用LASSO回归，并在TCGA和GSE14520队列中进行验证。

结果

3.1 单细胞转录组图谱揭示HCC肿瘤微环境的细胞组成

整合三个scRNA-seq数据集后，t-SNE可视化显示细胞来自28例患者且均匀分布，表明数据整合效果良好。通过无监督聚类识别出六大细胞群体：T细胞（18,679个）、B与浆细胞（1,446个）、髓系细胞（8,549个）、内皮细胞（2,488个）、成纤维细胞（1,969个）和肿瘤细胞（10,301个）。各细胞类群通过经典标记基因的表达得到确认，例如T细胞高表达CD3E和IL7R，髓系细胞表达C1QB与LYZ，肿瘤细胞则表达AMBP和APOA1。inferCNV分析进一步验证了肿瘤细胞的恶性特征，其拷贝数变异（CNV）强度显著高于参照T细胞。

3.2 肿瘤细胞异质性：三大亚群的识别与特征

聚焦肿瘤细胞后进行重新聚类，共识别出三个转录异质性亚群：Tumor_C0、Tumor_C1与Tumor_C2。差异表达分析显示，Tumor_C0高表达代谢相关基因如ALDOB和ARG1，提示其具有代谢活性表型；Tumor_C1上调S100A6与S100A11，这些基因与上皮-间质转化（EMT）和肿瘤转移相关；Tumor_C2则显著富集增殖与细胞周期相关基因，包括TOP2A、STMN1和HMGB2。功能评分（AUCell）表明，Tumor_C2在干性、增殖、促转移及E2F靶通路等方面均显著高于其他亚群，同时表现出较高的免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD）特征，提示其虽具高恶性度，亦可能激活免疫应答。

3.3 发育轨迹与功能状态分析

通过Monocle和CytoTRACE进行伪时间分析，发现Tumor_C2位于发育轨迹的起始端，具有最高的干性评分和分化潜能，表明其可能作为干细胞样群体驱动肿瘤进展。相比之下，Tumor_C0和Tumor_C1则处于更分化状态。这一发现支持癌症干细胞（CSC）模型，即Tumor_C2或为维持肿瘤异质性和进展的关键亚群。

3.4 H2AFZ作为关键致癌基因的功能验证

在Tumor_C2中，组蛋白变体编码基因H2AFZ表达显著上调。TCGA数据分析显示，H2AFZ在HCC肿瘤组织中表达高于癌旁正常组织，且高表达与患者总生存期缩短显著相关。体外实验表明，在SNU-449和Huh7细胞系中敲低H2AFZ可降低H2A.Z蛋白水平，显著抑制细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。这些结果确认H2AFZ通过促进细胞周期进程和抑制凋亡，在HCC恶性进展中发挥关键作用。

3.5 T细胞功能状态及其与肿瘤亚群的互作

对T细胞亚群的重新聚类识别出五个功能群体：C0_Naive（初始T细胞）、C1_Cytotoxic（细胞毒性T细胞）、C2_Exhaustion（耗竭T细胞）、C3_Cycling（增殖T细胞）和C4_Tfh（滤泡辅助T细胞）。细胞互作分析显示，Tumor_C2与C3_Cycling和C2_Exhaustion亚群之间存在强烈相互作用，提示增殖性肿瘤细胞可能通过驱动T细胞进入增殖和耗竭状态，从而促进免疫逃逸。这一发现为免疫治疗提供潜在靶点，例如使用PD-1抑制剂逆转T细胞耗竭。

3.6 预后风险模型的构建与验证

基于Tumor_C2特征基因，利用LASSO回归构建了一个预后风险评分（STRS）。该模型在TCGA训练集、内部验证集及外部验证集（GSE14520）中均能有效区分高危与低危患者。Kaplan-Meier分析显示高危组总生存期显著缩短，时间依赖性ROC曲线下面积（AUC）在1年、2年和3年预测中均高于0.65，表明模型具有良好的预测性能和应用潜力。

讨论

本研究通过单细胞转录组分析深入揭示了HCC肿瘤微环境的细胞异质性，并识别出一个具有高干性、强增殖能力及免疫调节特性的肿瘤细胞亚群Tumor_C2。组蛋白变体H2AFZ被确定为该亚群的关键驱动基因，其表达促进肿瘤恶性表型，并与患者不良预后相关。同时，Tumor_C2与耗竭性和增殖性T细胞间的密切互作，凸显了肿瘤免疫微环境的复杂性及免疫逃逸机制。这些发现不仅深化了对HCC异质性和进展机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了依据：靶向H2AFZ或可抑制肿瘤干细胞特性，而联合免疫检查点抑制剂则可能逆转T细胞耗竭，从而改善患者疗效。研究的局限性包括数据横向性难以追踪细胞演化动态，以及缺乏空间转录组验证互作位置关系，未来需进一步开展体内实验和临床转化研究。

结论

综上所述，本研究系统描绘了HCC的单细胞转录图谱，鉴定出一个由H2AFZ驱动的增殖性肿瘤细胞亚群Tumor_C2，其在促进肿瘤恶性进展及介导免疫抑制微环境中发挥核心作用。构建的预后模型显示出良好的临床预测价值，为HCC患者分层和精准治疗提供新思路。H2AFZ作为潜在治疗靶点，以及针对T细胞耗竭的免疫治疗策略，有望成为未来HCC治疗的重要方向。